トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

遺伝子組換え動物における蛍光リポーターの発現により、生体内の疾患モデルにおいて実験的な操作に対する細胞応答を追跡することが可能になります。本手法では、ゼブラフィッシュにおいて薬理学的に選択的な細胞喪失を誘導し、標的細胞およびその近接細胞を高解像度の多色共焦点画像で取得します。薬剤投与直前、直後、およびその後一定の間隔を置いて撮影し、画像解析を行うことで、回復期における内因性幹細胞集団の活性化と、それに続く標的細胞の置換を実証します。

この手法は、「個別の細胞タイプを再生するためにどのような細胞的・分子的なメカニズムが用いられているのか」といった、再生生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。まず、交配によって得られたトランスジェニック卵を、受精後16時間の時点で0.3 x danio solutionを含むペトリ皿に移します。目的組織に色素沈着が現れる前に、チロシンase活性を抑制するためにPTUを添加してください。胚がアルビノでない場合は、胚を28.5 °Cでインキュベートします。

レポーターの発現が確認されたら、ペトリ皿を蛍光立体ズーム顕微鏡下に置き、目的のトランスジェーン発現に基づいて選別します。イメージングの前に、胚用培地を用いて0.5%低融点アガロース封入剤を調製し、40 °Cで保持しておきます。

必要に応じてtricaおよびPTUを添加します。静かに混ぜ合わせ、40°Cに戻します。tricaを含む胚培地に魚を入れ、麻酔をかけます。

約3分間で、魚は反応しなくなります。マイクロピペットを使用して移動させるには、約30 µLの麻酔液とともに個々の魚をカットしたピペットチップ内に吸い込みます。次に、ピペットを反転させ、魚を底に沈ませます。

チップを封入液に触れさせ、重力によって液が転移するようにします。アガロースが希釈されないように注意し、再利用できるようにしてください。マイクロピペットに残った麻酔溶液は廃棄します。

次に、同じチップを使用して、魚をペトリ皿に移します。約30 µLのマウント液の中で、目的の領域がaeros液滴の中心に来るように、魚を慎重に方向付けします。aerosが凝固するまで、魚が目的の向きに保持されていることを確認してください。

必要に応じて、1つのペトリ皿に複数の魚を固定することができます。アエロスが凝固した後、魚を共焦点顕微鏡のステージに運び、魚が完全に浸るまで、Trica（PTUを含むか含まないか）を含む胚培地を皿に静かに加えます。イメージングソフトウェアを起動し、細胞および／または分子レベルの詳細を最適にイメージングするために、関心領域にフォーカスを合わせます。

ソフトウェア内で、開口数が高く作動距離の長い対物レンズを使用してください。ダイアルリストから適切な蛍光を選択します。スペクトル設定（spectral setting）をクリックし、放出波長範囲を調整してください。

レポーター信号を明確に分離し、信号対雑音比を最大化します。ソフトウェアで定義されたプリセットが適切に調整されるよう、ドロップダウンメニューから適切な対物レンズを選択してください。レーザーのフォーカス合わせおよび出力レベルの設定を行うには、各チャネルでピクセル飽和が確認できる出力をルックアップテーブルから選択してください。

次に、希望する画質が得られるように検出器の感度を設定し、画像強度が許容範囲になるまでレーザー出力を徐々に上げます。関心領域でのピクセルの飽和を避け、光退色および光毒性の問題を軽減するため、レーザーレベルは可能な限り低く維持してください。

すべてのイメージングチャンネルをモニタリングしながら、レーザーを手動でオン・オフにし、各レーザーラインが適切なチャンネルでのみ検出可能な信号を生成することを確認してください。クロストークが見られない場合は、すべてのチャンネルを同時に取得できます。次に、ズームおよび回転機能を使用して、関心領域をフレーミングしてください。

次に、スキャン速度と画像サイズを設定します。スキャン速度を速くすることで、レーザーの滞留時間が最小限に抑えられ、時間分解能が向上します。Z方向のステップサイズは、実験上の必要に応じて設定してください。ここでは、網膜組織の7つの光学切片を画像化するために、10 micronsのステップサイズを使用しています。

適切な設定が決定したら、Zack画像を撮影して保存します。その後、次の魚に移動します。付属の文書の指示に従い、数日間にわたる細胞変化を追跡するために、連続的なキャッチ・アンド・リリース撮影を行うことができます。

マルチレポーターイメージング実験を行う際は、十分に分離した蛍光色素を使用するのが最適ですが、実際にはそれが常に可能であるとは限りません。ここでは、励起および蛍光スペクトルが重複する蛍光色素（今回の例ではGFPとYFP）を分離するために、オープンソースソフトウェアであるImageJを用いた簡便な画像減算法を紹介します。

このビデオで説明しているタイムラプスイメージング技術は、網膜双極細胞の除去および再生過程におけるGFP標識網膜幹細胞のモニタリングに使用されています。スペクトル分離を行うには、シーケンシャルイメージングモードと可変バリアフィルター設定を用いて画像を収集します。これにより、重複する蛍光をそれぞれ独立して、あるいは部分的に分離して取得することが可能になります。画像の取得後、ImageJのloci bioフォーマットインポートを使用して画像ファイルを開き、インポートツールを起動します。対象のファイルをImageJウィンドウにドラッグしてください。

Align Three TPプラグインを開始する際、インポートウィンドウの「Split Channels」チェックボックスを使用して、チャンネルを個別のスタックに分割します。「Plugins」をクリックし、「Align Stacks」を選択してから、「Align Three TP」をクリックしてください。

適切な減算を行うために、スタックを整列させる必要があります。最初のドロップダウンボックスでリファレンススタックを選択し、2番目で位置がずれているスタックを選択します。「use XY relative origin」と「use Z relative origin」のボックスにチェックを入れ、「okay」をクリックします。

アライメント処理を開始するには、ボリュームレジストレーションボタンをクリックします。アライメントパラメータを含む新しいウィンドウが表示されます。「OK」をクリックしてください。

このセクションはプラグインのディストリビューターによって最適化されているため、修正は不要です。完了すると、アライメント済みスタックウィンドウが表示されます。出力ウィンドウを開くには、アライメント済みウィンドウから出力（output）を選択してください。

このウィンドウも最適化されており、変更は不要です。「OK」をクリックしてください。ファイル名の末尾に「aligned」が付加された新しいスタックがワークスペースに表示されます。

Image Calculatorを使用してクロストークを除去するには、[Process]から[Image Calculator]をクリックします。[Image 1]のドロップダウンボックスで差し引かれるスタックを選択し、[Image 2]のドロップダウンボックスで差し引くために使用するスタックを選択します。[Operation]のドロップダウンボックスで[Subtract]を選択し、[OK]をクリックします。

Image Jでスタックを処理するか確認されるので、「はい」を選択します。これにより、重複するチャンネル間のクロストークが除去された新しいスタックが表示されます。

アライメントおよび減算前の画像構造を再現するために、スタックを統合します。チャンネルツールウィンドウで統合するチャンネルを選択することで、最大4つのスタックをハイパースタックに統合できます。最後に、各チャンネルに色を付け、明るさとコントラストを調整し、ファイルをtiffs形式で保存して、ニトロレダクターゼの標的的な消失と再生を解析します。

M cherryを発現する網膜双極細胞。処理前に、個々のゼブラフィッシュにおいて共焦点画像のタイムシリーズ撮影が行われた。黄色で示されているのは、制御された双極細胞における膜タグ付きYFPリポーターのモザイク発現であり、赤色で示されているのは、標的とした双極細胞におけるニトロレダクターゼ・cherry融合タンパク質である。

シアン色で示された膜標識CFP導入遺伝子は、明瞭さを高めるために他のほとんどの網膜細胞に関するコンテキスト情報を提供しています。メトロニダゾール処理後の同じ画像では、CFP信号が消失しています。赤色のニトロレダクターゼ発現バイポーラ細胞は消失していますが、黄色のコントロールバイポーラ細胞は維持されています。

これは、このアブレーション手法の極めて高い特異性を示すものです。分かりやすくするため、再びCFPのない同じ画像を示します。metro NIAZを除去すると、NTR発現細胞がここに回帰します。

G-F-P-Y-F-P減算法の例をこの図（GFP標識されたMüller細胞）に示します。GL細胞は緑色で、YFP標識された双極細胞は紫色で示されています。これら2つの重なり部分が白色となり、これにより減算が行われます。

まず、GFP画像とYFP画像の位置合わせを行う必要があります。次に、減算処理によってYFPで標識された双極細胞をGFP画像から除去することで、GFPで標識されたミュラー細胞を鮮明に表示し、より暗いミュラー細胞を検出できるようにします。これにより、暗いミュラー細胞、ggl、および赤色で示されるmCherry標識双極細胞の重複を確認することができます。

ここで示されたデータは、双極細胞の除去がミュラー glia を刺激し、失われた細胞を補充させることを示唆しています。この解釈は、哺乳類と魚類の両方においてミュラー glia が傷害誘発性の前駆細胞として関与しているとする、網膜再生に関する最近の研究結果と一致しています。この手法により、ゼブラフィッシュにおける幹細胞の可視化を通じて、特定の細胞型の再生を制御するメカニズムを探索することが可能になります。