アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

本実験の全体的な目的は、RBB2ヒストン脱メチル化酵素であるKDM5A（Jared1）のゲノム標的を特定することです。まず、架橋クロマチンを調製し、次にソニケーションを行うことで適切なサイズのDNA断片を生成します。その後、RBB2抗体を用いてRBB2結合DNA断片を免疫共沈殿させます。

次に、回収したゲノムDNAをPCRで増幅し、シーケンシングを行います。最後に、Illuminaでシーケンシングしたショートリードをヒトゲノムに一意にマッピングし、有意なピークを特定して、最も近い遺伝子にアノテーションします。Rbbb twoの標的遺伝子を特定するために、ゲノムワイドなRbbb two濃縮領域の同定に基づき、Rrb B twoの標的遺伝子2つに関連する分子機能を示す結果を得ます。

こんにちは、マイクです。私はイリノイ大学シカゴ校の生化学・分子遺伝学部のElizabeth Bencia博士の研究室に所属しています。そして私はアラで、バルセロナ生物医学研究パークのNGA博士率いる生物医学ゲノミクス研究室に所属しています。

私はダニエル・ダルです。私はウィリアム・リヒターです。私たち both は、ベネボレンス・スキルラボに所属しています。

本日は、クロマチン免疫沈降およびシーケンシングの手順をご紹介します。当研究室では、ヒストン脱アセチル化酵素の結合部位を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。

本手順を開始するために、約10⁸個の細胞を培養します。これは、各免疫沈降（ip）において、びまん性骨溶解性リンパ腫を用いる場合です。

U 9 37細胞を用い、細胞を増殖させた後、TPAで96時間誘導して単球分化させます。ホルムアルデヒド溶液を培地に直接添加し、最終濃度を1%にします。その後、フラスコを軽く回して撹拌し、室温で10分間静置します。次に、培地を吸引し、氷冷したPBS 15 millilitersで細胞を洗浄します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。

次に、氷上の各フラスコに6 mLのライシスバッファー1を加えてください。その後、4 °Cで20分間、フラスコを振盪させます。最後に、セルスクレイパーを用いて細胞を回収し、15 mLコニカルチューブに移します。

この時点で、細胞を−80°Cで保存できます。細胞を凍結保存していた場合は、解凍してください。解凍後、細胞を遠心分離して回収し、上清を捨てます。

次に、細胞を6 mLのライシスバッファー2に再懸濁し、室温で10分間チューブを緩やかに回転混和させます。再び遠心分離を行い、細胞を2.5 mLのライシスバッファー3に再懸濁します。続いて、懸濁液を氷水の入ったビーカーに入れ、Branson 450ソニケーターのマイクロチップを振幅50〜60%に設定し、超音波処理の準備をします。

溶液を32秒間一定の間隔でソニケーションし、氷上で冷却します。このパルス処理を1分間につき10〜15回繰り返し、その後、チューブの内容物をピペッティングして新しいチューブに移します。引き続き、溶液のパルス処理と冷却を繰り返します。

超音波処理をさらに5回繰り返した後、溶液量の10分の1に相当する量の10% Triton X 100を加えます。次に、溶解物を1.5 mL遠心チューブに移し、クロマチン免疫沈降（ChIP）を行う前にマイクロ遠心機でデブリを沈降させます。細胞溶解液のうち50 µLをインプットサンプルとして保存してください。

次に、清澄化した細胞溶解液を、記載されたプロトコルに従ってあらかじめ調製した抗体結合dyna beadsと混合させます。この混合液に50 µLのインプットサンプルを加え、4 °Cで一晩ローキングします。その後、1 mLの洗浄バッファーでビーズを洗浄します。

次に、マグネットスタンドを用いてビーズを回収し、上清を除去します。この洗浄操作を6〜8回繰り返します。最後に、1 mLのTEに50 mMの塩化ナトリウムを加えた溶液で最終洗浄を行います。

遠心分離後、マイクロ遠心機でビーズをスピンさせ、残存しているTEバッファーを吸引して除去します。その後、直ちにサンプルに100 µLの溶出バッファーを加えます。

サンプルを65 °Cで10〜15分間インキュベートします。ビーズを懸濁状態に保つため、2分ごとに1.5 mLチューブラックでチューブを軽く擦ってください。遠心分離とマグネットスタンドを用いてビーズを回収し、上清をPCRチューブに移します。

次に、保存しておいたインプットサンプルを回収し、3容量分の溶出バッファーを加えます。最後に、IPサンプルとインプットサンプルをサーマルサイクラーに入れ、65 °Cで一晩処理します。翌日、架橋を解除するために、サンプルに1容量分のTEバッファーを加えます。

次に、RNA Aを最終濃度0.2 µg/µLになるように加えます。サンプルをサーマルサイクラーで37 °Cで1〜2時間インキュベートします。インキュベート後、プロテイナーゼKを最終濃度0.2 µg/µLになるように加えます。

次に、サンプルをサーマルサイクラーを用い 55 °C で2時間インキュベートします。続いて、1容量のフェノールでサンプルを1回抽出します。さらに、1容量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールでサンプルを2回目に抽出します。

最後に、クロロホルム・イソアミルアルコール等量を用いて、サンプルをもう一度抽出します。次に、各サンプルに30 µgのグリコーゲンを添加します。さらに、塩化ナトリウムを最終濃度0.2 Mとなるように加え、サンプルに2容量のエタノールを添加します。

これらを-80°Cで30分間インキュベートします。インキュベート後、サンプルを遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを500 µLの75% ethanolで洗浄し、その後ペレットを乾燥させ、40 µLの水に再懸濁します。

超音波処理（SONICATION）によって生成されたDNA断片のサイズを確認するため、精製した入力サンプル5 µgを1.8%アガロースゲルにロードして電気泳動を行います。超音波処理により、断片サイズが150から350 bpの範囲に収まっている必要があります。もし断片がこの範囲にない場合は、ゲノムDNAの増幅前に、バースト回数と振幅を変更して超音波処理の条件を調整してください。

書面プロトコルに従い、サンプルのサイズ、濃度、および濃縮度を確認します。ゲノムDNAの増幅を開始するために、IPサンプル34 µLとインプットサンプル200 ngを分取します。書面プロトコルに従い、IlluminaゲノムDNAサンプル調製キットを用いて、DNAフラグメントへのA-tail付加およびアダプターのライゲーションを行い、修復します。

ミニPCR浄化キットを用いてDNAを精製し、50 °Cに予熱したバッファーEBで溶出します。IP用DNAサンプルには23 µL、インプット用DNAサンプルには46 µLを使用してください。アダプター付きDNA 23 µLと、キットに含まれる融合DNAポリメラーゼ 25 µLを用いてPCR反応を行います。

20 µMのsole PCR oneを1 µLと、20 µMのsole PCR twoを1 µL加え、記載のプロトコルに従ってPCR反応を行います。PCR増幅後、Qiagen mini loop PCR purification kitを用いてDNAを精製します。

15 µLのバッファーEBを50 °Cに予熱し、サンプルの0.5 µLを1対4で希釈し、NanoDropで測定して増幅産物を精製します。HPLCグレードの水を用いて50 mLの1.8% AGROSゲルを調製し、AGROSが溶解した後にTAEと臭化物を添加します。その後、ゲルを流し込み、サンプルをロードします。

インプットサンプルおよびIPサンプルに4 µLのローディングバッファーを加え、120 Vで45分間ゲル電気泳動を行います。泳動後、ゲルを解析します。これにより、150 bpから350 bpの範囲の断片が生成されていることが確認されるはずです。

これらは50から250塩基対の長さのゲノムDNA断片に相当します。次に、メスを用いて、150から350塩基対の範囲に物質が含まれるゲル領域を切り出します。この際、約120塩基対に位置するアダプターバンドを切り出さないように注意してください。

メーカーの指示に従い、Kaye Quick Gel Extraction Kitを用いてDNAを回収します。サンプルをSpeedVacを用いて加熱せずに正確に11 µLまで乾燥させます。サンプルの1 µLを分取し、NanoDrop分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。

最後に、Illuminaゲノムアナライザーを用いて濃縮された遺伝子産物を同定し、記述プロトコルに従って結合部位および標的遺伝子を解析します。同定された濃縮RB結合タンパク質2またはRBP2結合領域のゲノム座標は、染色体ごとの形式で提示されます。染色体におけるアンサンブル遺伝子の占有状態は、黒色のVARとして可視化できます。

ここでは第10染色体の占有状態が示されており、RBP2の結合領域が垂直線として表示されています。中央のパネルは、第10染色体におけるすべてのRBP2アイソフォームの結合領域を示し、下段のパネルは、RBP2のラージアイソフォームの結合領域を示しています。これらの情報は、第10染色体におけるRBP2アイソフォームの重複および特異的な占有の概要を提供するものです。

ここでは、RBPに結合した遺伝子における、偽発見率（FDR）で補正した有意に濃縮されたジーンオントロジー（GO）分子機能カテゴリーのヒートマップを示しています。赤に近い2つの色は統計的有意性が高いことを示しています。黄色は統計的有意性が低く、灰色は統計的有意性がないことを示しています。

濃縮分析により、R BP 2標的遺伝子の重複およびアイソフォーム特異的な分子機能が示されています。この手順において、転写因子の結合部位を特定する方法を説明しました。適切なサイズ範囲と収量のDNA断片を作製することが重要です。

これは、SONICATION（超音波処理）ステップにおいて当社のガイドラインに従うことで達成できます。以上となります。皆様の実験がうまくいくことを願っております。ご視聴ありがとうございました。