多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

本実験の全般的な目的は、クロマチン免疫沈降シーケンシング（ChIP-seq）データのマッピング済みリード位置の密度を利用して、ゲノム全体におけるリード密度の事後平均を推定することです。これは、マッピングされたChIP-seqリードを、200 bpの非重複ビン内に同一数のリードが含まれるブロック密度プロファイルへと前処理することによって達成されます。

第2ステップとして、密度が同じである隣接するビンを統合して大きなブロックを作成します。次に、前方・後方フィルタを備えたベイズモデルを用い、周囲のすべてのブロックを考慮して、各ブロックの事後平均密度を再帰的に計算します。ここで、ブロックのリード数は、アルファおよびベータパラメータを持つガンマ事前分布に従うシータパラメータを備えたポアソン分布でモデル化されます。続いて、最終的な濃縮ゲノムセグメントを生成するため、各ブロックの事後平均密度の推定値が、入力コントロールのバックグラウンド密度に対する第90パーセンタイル（90th quantile）を超えるかどうかに基づいて、その有意性を評価します。これにより、BCP解析におけるChIP-seqデータの、生のシーケンスリードから事後平均リード密度の推定値、そして最終的な濃縮アイランドに至るまでの過程がもたらされます。

さらに、結果はBCPが競合ツールであるcerを上回る性能を持つことを示しています。CERのような既存の手法に対するこの手法の主な利点は、BCPが隠れマルコフモデルにおける最新のAの進展を利用しているため、従来のヒューリスティックな手法よりもチップシーデータの解析におけるニュアンスをより適切に特性評価できる点にあります。この手法は、ゲノム全体の濃縮パターンを特性評価することで、histo修飾の役割といったエピゲノミクス分野における重要な課題の解決に寄与します。

本手法はChIP-seqデータの解析に洞察をもたらしますが、その基本フレームワークは、バイサルファイトシーケンシングデータにおける差次的メチル化領域の同定、RNA-Seqにおける新規転写遺伝子座の同定、コピー数多型、あるいはあらゆるマイクロアレイタイリングデータの解析など、他の次世代シーケンシングデータの解析にも適用可能です。本手法を視覚的に提示することは、その手法および利点を明確に理解する上で極めて重要です。理論的な利点は、ソフトウェアの内部に組み込まれています。

ここで実演したすべての手順は、本ビデオからダウンロード可能なBCPソフトウェアパッケージ内の単一の実行ファイルにまとめられています。ソフトウェアを実行するための、プログラムによって処理される手順について説明します。3つのパラメータが必要です。

チップサンプルのユニークにマッピングされたリードを含むファイルと、インプットコントロールリード用の同様のファイル、およびBCP解析用のインプットファイルを準備するための出力ファイル名を用意します。まず、シーケンシングランから得られたショートリードを、推奨されるショートリードアライメントソフトウェアを用いて適切なリファレンスゲノムにアライメントします。マッピングされた位置は、6列のブラウザ拡張データ（BED）形式に変換してください。これは、マッピングされたリードごとにタブ区切りの1行で構成され、マッピング先の染色体、開始位置、終了位置、リード名、スコア、およびストランドを示す形式です。

チップおよびインプットのマップ上の位置を、あらかじめ設定したフラグメント長まで拡張します。例えば、DNAの酵素消化またはソニケーション時に標的としたフラグメントサイズ（通常は200 base pairs前後）などが該当します。その後、フラグメント数は隣接するビンに集計されます。

デフォルトでは、ビンのサイズは推定断片長である200 base pairsに設定されています。リード数が同一である一連のビンにおいて、変化点が発生する可能性があるのは、ほぼ間違いなく最も外側の境界であると考えられます。したがって、リード数が同じである2つのビンの間の内部境界で変化点が発生する可能性は低いです。

したがって、1ビンあたりのリード数が同一である隣接するビンを1つのブロックとしてまとめます。入力ファイルを準備した後、画面下に表示されているコマンドを入力してBCP推定を実行します。各ブロックのリード密度は、平均パラメータthetaを持つポアソン分布としてモデル化され、このthetaはalphaおよびbetaパラメータを持つガンマ分布の混合分布に従い、各ブロックで変化点が発生する事前確率が付随します。

各ブロックをこのようにPで条件付ける境界設定は、実質的に無限状態隠れマルコフモデル（HMM）を構築することになります。ハイパーパラメータであるalpha、beta、およびPは、最大事後尤度を用いて推定されます。ベイズ推定では、各ブロックtheta sub Tについて、why sub Tが与えられたときのtheta sub Tの期待値として明示的に算出されます。HMMで頻繁に用いられる、より伝統的ですが時間のかかるフォワード・バックワードフィルタの代わりに、計算効率の高い有界複雑度混合近似（bounded complexity mixture approximation）を用いて事後平均theta hat sub Tを推定します。得られた事後平均は近似的な区分的定数プロファイルとして平滑化されるため、同一のtheta hat sub Tを持つブロックは、更新された境界座標とともにさらに統合される必要があります。

BCPは、ブロックあたりの入力リード数を背景速度として使用し、濃縮を判定します。これは、ブロックのチップ位置の平均密度がある有意性のしきい値を超えるかどうかに基づく、単純な仮説検定を用いて行われます。デフォルトのしきい値として90パーセンタイル（第90分位数）が使用されており、ほとんどの場合において適切です。

次に、BCPは濃縮度を超える隣接する事後平均密度ブロックを単一の領域に統合し、統合された座標をブラウザに報告します。拡張データフォーマットに対応したBCPは、ヒストン修飾データの広範な濃縮領域を特定することに長けています。ここでは、BCPの結果を、既存のツールであり強力な性能を示しているcserの結果と比較します。本研究室によるH3K36トリメチル化の研究という先行作業では、cserよりもBCPの方がアイランドサイズが大幅に大きくなる傾向があることが示されていました。

より大きなアイランドは、H3K36三メチル化濃縮領域が広範囲に分散して存在するするという一般的な予想とより一致しています。しかし、アイランドが大きいことだけでは正確さを示すものではありません。したがって、H3K36三メチル化アイランドが活性転写遺伝子本体と関連していること、およびH3K27三メチル化アイランドと相互排他的であるという既知の特性を用いて、BCPとCERの性能を評価しました。CERと比較して、BCPは、H3K27三メチル化アイランドとの重複を増やさずに、遺伝子本体をより適切に捉えることができる、より大きな連続したアイランドを抽出しました。

BCPは、H3K36三メチル化アイランドと遺伝子本体との境界を密接に整合させることで、活性遺伝子の高いオーバーラップを維持し、同時に、転写が抑制された遺伝子間領域の遺伝子や、H3K27三メチル化という抑制性マークとの誤検出（偽陽性）によるオーバーラップを増加させません。2つの複製データセットにおけるBCPアイランドコールの再現性を評価したところ、BCPは競合アルゴリズムであるcserに見られるようなリードカバレッジ深度への強い依存性がないことが観察されました。さらに、他の異なる領域を検討することでBCPの堅牢性と再現性の追加的な証拠が得られ、カバレッジ深度が低下してもアイランドの境界が一貫していることが実証されました。BCPの汎用性を完全に実証するため、H3K27三メチル化およびH3K36三メチル化に加えて、点状のマークであるH3K27アセチル化、H3K9アセチル化、H3K4三メチル化、および拡散したマークであるH3K9三メチル化を含む、広範なヒストン修飾データを入手しました。これらのデータセットを、BCPとcserの両方のデフォルトパラメータ設定を用いて解析しました。

中心には、活性転写を示すPXDN遺伝子におけるH3K36三メチル化の濃縮が見られ、転写開始点では予想通りに減少しています。さらに、H3K27アセチル化、H3K9アセチル化、およびH3K4三メチル化といった、点状の活性化マークも認められます。PXDNの直下流には、H3K27三メチル化の濃縮によって標識された抑制的な遺伝子間領域が存在し、反対側の隣接領域にはH3K27三メチル化により抑制された遺伝子が存在します。さらに一歩外側へ移動します。

H3K9 trimethylationの蓄積によって示されるサイレンシングされたクロマチンは、おそらくH3K27 trimethylationによる抑制よりも永続的な意味で、SNTG2およびMYT1Lのサイレンシングを示していると考えられます。この領域には、ヒストン修飾のChIP-seekで遭遇する現象の大部分が含まれています。これは、BCPのダイナミックな性質によって、点在するアセチル化およびH3K4 trimethylationマークを特定できる一方で、同時に、H3K27 trimethylationおよびH3K9 trimethylationによる抑制の広範で連続的なアイランド領域や、H3K36 trimethylationによる活性転写を区別できることを示しています。

このアルゴリズムは、リード数とゲノム解析の結果に応じて、おおよそ30分で完了します。他の手法でしばしば必要とされるような大幅な最適化は、本手順の後には不要です。BBCPを用いることで、さまざまなヒストン修飾やDNA結合転写因子を含む、クロマチン免疫沈降の多種多様な標的タンパク質を解析することができ、エピゲノムメカニズムや遺伝子調節に関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。

このビデオを視聴することで、ChIP-seqデータ解析において、拡散したヒストンマークの到達範囲にある領域を特定するためにBCPがどのように使用されるかを十分に理解できるはずです。