暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

視覚体験は、網膜の光受容体にある視物質が光エネルギーの光子を吸収することから始まり、最終的に細胞膜上の環状ヌクレオチド依存性チャネルを閉鎖させます。これにより、桿体細胞と錐体細胞の両方から神経伝達物質であるグルタミン酸の放出が抑制されます。放出されたグルタミン酸は下流の網膜細胞によって感知され、これにより下流の信号を解析することが可能になります。

安楽死させたマウスから眼球を摘出します。Sを単離してアガロースブロックに埋め込み、振動ミクロトームを用いてスライスします。次に、網膜スライスを顕微鏡下に配置し、LED照明で刺激します。

シナプス電流または電位を測定するために、パッチクランプ記録を行います。一般的に、この手法に不慣れな方は、暗所での作業という複雑さが加わるため、習得に苦労します。そのため、プロセス全体を視覚的に確認できれば、言葉では説明しにくい感覚を掴むことができるでしょう。

まず、使用する記録電極および参照電極のワイヤーに塩化銀の層をコーティングします。電極を1 Mの塩化ナトリウム溶液に浸します。次に、1 Hzの正弦波を持つ15 Vの電源を用い、電極間に15 Vの電圧を約20秒間印加します。

マイクロピペットプラーを使用し、火炎研磨したBOシリカガラスからパッチピペットを作製します。パッチピペットの先端抵抗は、標的細胞のサイズに基づいて選択し、直径約20 µmの細胞体には5～10 MΩの先端抵抗を持つピペットを使用します。直径約5 µm以下の細胞体には、12～15 MΩの先端抵抗のものを使用してください。

接地参照電極を準備するには、シリンジを用いて、1 mM 塩化ナトリウムで調製した 3.5% アガー溶液をポリエチレンチューブに充填します。次に、付属の書面プロトコルの指示に従い、以下の溶液を調製します。外部浴溶液、スライス溶液、アスパラギン酸カリウムピペット内部液、およびアガーバックストップです。

すべての溶液は、使用するまで4 °Cで保存してください。実験当日に、約1.5 mLのコハク酸カリウム内部液を注入します。その後、希釈したFluorを添加します。

重炭酸ナトリウムを含むAims媒質約50 millilitersを遮光保存容器に注ぎます。Aims媒質をガスで平衡化させるため、5%carbon dioxideおよび95%oxygenを含むガスタンクにプラスチックチューブを接続し、容器を30 to 32 degrees Celsiusの恒温水槽に入れます。次に、HEPESを含むAims媒質110 millilitersをボトルに満たし、氷上に置きます。

100%酸素ガスを溶液にバブリングして、培地を等しくします。炭酸水素ナトリウムを含む残りのAimes培地を、ファラデーケージ上部の加熱リザーバーに入れます。チューブとボトル上部をパラフィルムで巻き、溶液上の空間にガスを閉じ込め、5%二酸化炭素、95%酸素ガスで平衡化させます。

ガラス製エアディスパーションチューブを用い、0.75 gの低融点アガロースを25 mLのAIMs培地に加え、加熱して3%低融点アガロース溶液を調製します。攪拌しながら、溶液を約115 °Cまで加熱します。溶液から気泡が消え透明になったら、融解したアガロース溶液を42 °Cのウォーターバスに移します。

倒立顕微鏡の上に記録チャンバーを設置します。5 cmのアガーブリッジを銀・塩化銀参照電極の上にスライドさせ、記録チャンバー内に配置します。ピペットを内部液で満たし、ピペットホルダーに装着し、さらにホルダーをアンプのヘッドステージに差し込み、ピペットを溶液中に浸すことで、ピペットチップの抵抗値を測定できます。生理学的記録において視覚色素を保存するため、すべての操作は赤外線ゴーグルを着用し赤外線灯下で行う必要がありますが、ここでは便宜上、室灯下での手順を示します。

マウスを安楽死させた後、曲がり鋏を用いて速やかに眼球を摘出します。眼球が転がらないよう、フィルターペーパーの上に置きます。次に、ピンセットで眼球を固定し、薄い両刃のメスを用いて角膜に切り込みを入れます。

眼球に穿刺したらすぐに、眼球をAIMS培地を満たした60 mmのペトリ皿に移します。角膜の切開口を進入路として、小さな鋏を用いて角膜の残りの部分を切り除きます。

次に、水晶体と硝子体を摘出し、網膜が眼杯に付着したままであることを確認します。これを、32 °Cで95%酸素および5%二酸化炭素で平衡化したAIMS培地を満たした遮光容器に入れます。

次に、10番のメスを用いて眼杯の半分を切り出します。網膜を網膜色素上皮から分離してください。

組織を平らに固定するため、網膜の縁を取り除きます。ラテックスバルブ付きの小型ガラスパステールピペットを使用して、35 mmのペトリ皿に溶融した低融点アガロースを満たし、ピンセットをアガロース内で動かして硬さを確認します。アガロースが凝固し始めたら、網膜をアガロースの上に転移させます。

次に、網膜に触れないように、ねじったキムワイプを使用して周囲の余剰溶液を吸収します。網膜の上にアガーをさらに2〜3滴直接滴下し、すぐにプラスチックシリンダーを配置して周囲に壁を作ります。網膜をシリンダーの中央付近に保持したまま、溶融アガーを追加で滴下し、シャーレを氷水バスに移して冷却します。30秒後、組織を取り出し、プランジャーを用いてアガーブロックを押し出し、網膜から最も遠い側から押し出します。

片刃のカミソリを使用して、網膜を含むアガロースの小ブロックを切り出し、検体ディスク上のアガロース製ストッパーに接するように瞬間接着剤で固定します。検体ディスクを振動マイクロトームの台座にセットし、氷冷したAIMS溶液を台座に注ぎ、網膜を含むブロックが完全に浸かるようにします。ブレードの振動速度を最大に設定し、網膜を1回切り抜くのに4〜5秒かかるように前進速度を調整して、厚さ約200 µmの網膜スライスを作成します。

11番のメス刃を使用して、ブロックから使用可能なスライスを1枚ずつ切り出します。網膜を含むスライスを記録室に配置し、固定します。スライスアンカーを用いて、ナイロン糸をスライスアンカーに交差させて固定します。

網膜を遮ることのないよう、網膜周囲のアガロースを固定します。記録を行うため、記録チャンバーを正立顕微鏡のステージに移動させます。

カーテンを閉じて赤外線光源を点灯し、赤外線感度カメラでスライスを観察します。顕微鏡下で、適切な切断角度で光受容体が保持されている網膜スライスを確認します。スライス工程により、表面に一部損傷が見られる場合があります。

先端をカットしたピペットを用いて、死細胞の細胞体を静かに吸引して除去します。この薄い細胞層を取り除き、健全な生細胞層が現れたら、目的の層に位置する細胞体を特定します。ピペットチップを移動させて細胞膜にわずかな窪みを作り、緩やかな陰圧（内向きの圧力）をかけて、抵抗値の高いシールを形成します。その後、電極に陰圧をかけて細胞内へ侵入することで、ホールセルモード（whole cell mode）に移行します。

次に、LEDを用いて網膜組織に光刺激を与え、応答を誘発させます。記録の終了後、ピペット内部溶液から細胞内に透析されたフルオロフォアに適した励起光を用いて画像をキャプチャします。ここでは、暗適応させた網膜ニューロンに対し、強度を増した光フラッシュを与えた際の光誘発電位を示しています。

この図は、細胞にLucifer yellowを充填した網膜切片の蛍光写真であり、誘発された蛍光はパッチクランプ記録を行った細胞の形態を示しています。このビデオを視聴することで、暗順応させた網膜切片からパッチクランプ記録を行う際の複雑さについて、より深く理解できるはずです。この手順の目的は、制御された照明条件下で光誘発反応を測定することです。

これを行うには、まず網膜を分離してアガーに埋め込み、次に単一細胞記録が可能な網膜スライスを作成する必要があります。