パッチクランプキャパシタンス測定とCa ^{2 +イメージング}

本手順の全体的な目的は、前シナプス側双極細胞神経終末に位置するマイクロ回路の研究のために、アガロース埋込み網膜スライスを調製することです。まず、暗順応させたキンギョの眼から網膜を取り出し、その網膜から小さな長方形の断片を切り出します。次に、この網膜断片を透明で低融点のアガロース溶液に浸し、適切な低温のスライス溶液中で固化させます。

次のステップでは、ビブラトームを用いて、網膜の矩形片を含む固体アガロスのブロックをスライスします。最終ステップでは、可視化、同定、およびパッチクランプを行います。双極細胞の神経終末をクランプしてください。

最終的に、霧化および無傷の両極細胞終末からの膜容量測定により、シナプス前カルシウム電流とシナプス物理的エキソサイトーシスが示されます。こんにちは、ハン・キムです。バーナム研究所のPCOラボのポストドクターです。

本日は、金魚の冷 facial retina（顔面網膜）のAGA埋没切片作成法を紹介し、単一パイプラインでのパッチクランプ容量測定を実演します。まず、スプリングシザーを用いて目の前面を均等に切り、金魚の眼球を半分に分割します。次に、カルシウムを含まない冷却切片溶液にアイカップを浸します。

必要に応じて、ピンセットで水晶体を除去します。次に、45度角度付き微小鑷子を用いて網膜を眼球から剥離させ、網膜に付着している網膜色素上皮層を除去します。その後、微小鑷子またはスプリング鋏で視神経を切断します。

次に、改造したパスタピペットまたは大容量チップ転送ピペットを用いて吸引します。網膜を取り出すために、網膜に付着している残りの色素上皮を慎重に除去します。洗浄され、健全な状態の網膜表面は滑らかに見えるはずです。

次に、分離した網膜を約0.03%のIDEで室温にて15～30分間処理します。硝子体を除去する際、この操作は低照度下で行う必要があることに注意してください。次のステップでは、カミソリで湾曲した端を取り除き、網膜の全層を含む約2 mm × 2 mmの長方形の網膜片を切り出します。

次に、網膜片をアガロース溶液を満たした小型容器に移します。この際、液体アガロースに網膜を配置する際に、網膜周囲の溶液量を最小限に抑えるようにしてください。続いて、アガロースと共に網膜を氷冷したスライス溶液に直接浸し、アガロースを凝固させます。次に、長方形の網膜片を含む凝固したアガロースブロックを、1 cm × 1 cm × 1 cmの立方体に切り出します。

ブロックをprecoスライスチャンバー内のスライスプレート表面に接着します。次に、氷冷したスライス溶液中で、ブロックを200〜250 µmの厚さにスライスします。ビブラトームを使用することで、合計5〜10枚のスライスを得ることができ、これらは約5〜6時間生存可能です。

その後、スライスの1枚を記録チャンバーに移します。ナイロン糸のグリッドが付いたU字型の白金製フレームをスライスの上に置きます。カーボゲンでバブリングした記録液を、毎分1〜2 mLの速度でスライスに持続的に灌流させます。

このステップでは、0.2 micronフィルターチップ付きのシリンジを使用して、ガラスパッチピペットに内部溶液を注入し、ピペットの背面から1〜2 cmの高さまで満たします。その後、チップから気泡を取り除きます。ピペットをホルダーに固定します。

ピペットに陽圧をかけ、マイクロマニピュレーターを用いて、チップをスライス方向へ下げながら目的の末端へと移動させます。チップと一緒にスライスが引きずられないよう、ピペットを側方に掃くように動かしてください。その後、ピペットチップを末端の周囲に動かし、膜表面を洗浄します。

チップを端子の端に押し付けてディンプルを作成し、正圧を解除します。すぐにギガオームシールが形成されない場合は、ピペットにわずかな負圧をかけます。ギガオームシールが形成されたら、EPC-9パッチクランプアンプをオンセル記録モードに切り替え、保持電位を-60 mVまたは-70 mVに変更します。

高速キャパシタンス補正を適用し、シール抵抗が 5 ～ 10 GΩ の間で安定するまで待ちます。その後、鋭く緩やかな吸引を行い、細胞膜を破裂させます。これにより、ホールセル記録構成を確立します。

シリンジの代わりにマウスサクション（口吸い）を使用することも可能です。アトマイズされたMB端子にホールセル構成が確立された後、-70 mVから0 mVまで200ミリ秒のステップ脱分極を適用します。この脱分極の前後に、ボルテージクランプモードで2 kHzの正弦波が適用されることに留意してください。膜容量を測定するため、この脱分極により、セシウムベースの内部溶液を用いて、電圧依存性L型カルシウムチャネルの開口によって活性化される内向きカルシウム電流を直接測定することが可能になります。

並行して、シナプス小胞のカルシウム依存性エキソサイトーシスによって膜表面積が増加し、それに伴う容量跳躍（capacitance jump）をモニタリングすることが可能です。もし、無傷のMB双極細胞のシナプス末端をピペットでパッチクランプした場合、MB双極細胞のギャップ結合によるカップリングに起因する大きなリーク電流があるため、識別可能なカルシウム電流は観察されません。そこで観察されるのは、大きな外向きのリーク様電流です。

しかしながら、図示された脱分極ステップの前後で活性化させた高周波正弦波刺激を用いて、キャパシタンスの跳躍をモニターすることが可能です。ここでは、M双極細胞終末の画像であるI-R-D-I-Cの例を示します。AおよびBに示すように、正常な終末は楕円形に見えやすく、一方でCは、円形に見える崩壊した終末を示しています。

色素充填法を用いて細胞終末を分類することも可能です。ここでは、Dに軸索が温存された、eに軸索が部分的に切断された、Fに軸索が完全に除去されたMBI双極細胞終末の蛍光画像の例を示します。それぞれの終末は青色の矢印で示されています。ここでは、カルシウムイメージング信号によるエキソサイトーシスと抑制性フィードバックの直接測定結果を示します。

MB二極細胞終末において、電圧クランプステップ脱分極によりMB終末のテレリアにおける一過性のカルシウム濃度上昇が活性化されました。対応するMBテレリアの蛍光画像はBに示されています。神経伝達物質放出の短期的なシナプス抑制の例はCに示されています。この手順を行う際は、網膜をキットアガーに配置する際に網膜周囲の溶液量を最小限に抑えることが重要です。これにより、アガーブロックへの固定状態が向上します。