腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

運動機能および言語機能の障害を含むパーキンソン病の症状は、脳内のドパミン分泌細胞の活性低下によって引き起こされます。腸管神経系と嗅球は最も外部に曝露されている神経構造であり、最初に影響を受ける部位です。パーキンソン病は、農薬への曝露との関連が指摘されています。

農薬が腸管神経系に及ぼす影響を解析するため、マウスに農薬rooneを経口投与します。その後、マウスの心臓内灌流に4%パラホルムアルデヒドを用い、脳および腸管神経系を固定します。組織を摘出し、調製後、PD関連タンパク質について免疫染色を行います。

共焦点顕微鏡によって得られたBeta three tubulinおよびalpha synucleinの画像は、農薬に曝露した動物の腸管神経系ニューロン内にalpha synucleinが蓄積していることを示しています。rotenoneの全身投与などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、rotenoneの効果が腸管神経系に限定されることが保証される点にあります。この手法は、パーキンソン病の病因や進行のメカニズムなど、重要な疑問を解明するのに役立ちます。

本手法の意義は、新たな治療標的や診断法の開発を可能にすることから、パーキンソン病の治療および診断へと広がります。この方法はパーキンソン病の病態生理に関する知見を提供しますが、他の環境毒素が腸管、交感神経系、副交感神経系、および腸壁に及ぼす影響の研究など、他のシステムにも応用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、ゾンド投与（gavage）を習得するまでに時間がかかるため、苦労することがあります。

私は、農薬とパーキンソン病の関連性についての記述を読んだとき、初めてこれらの手法を考案しました。また、2005年にベルリンで開催された世界パーキンソン病大会におけるCORAsの高レベルなカンファレンスを視察できたことも有益でした。この手法の穏やかな実証が必要です。

マウスの解剖学的構造はヒトとは異なるため、ゾンデ（gavage）によるolの投与は困難です。一方で、これらの画像解析にはカスタマイズされた手順が用いられました。まず、動物の体重を量ることからプロトコルを開始します。次に、ロテノン（rotenone）の適切な投与量を算出します。

動物の体重1gあたり0.01mL必要であり、これはrooneの投与量5mg/kgに相当します。1mLシリンジにroone溶液を充填し、次に2本目のシリンジに溶媒を充填します。マウスを手に取り、片手でマウスの尾を保持します。

もう一方の手の人差し指と中指で、首の皮膚を引っ張って伸ばします。頭部を2本の指で固定したら、手のひらに押し当てて反転させます。その後、尾部を固定します。

薬指と小指を使用して、頭部を後方に保持したまま口蓋を押し、マウスの口を開けます。胃管を口の中にゆっくりと挿入します。胃管の全長が挿入されるまで、胃の方向へゆっくりと進めてください。

物質が肺に入り込むのを避けるため、エンボラスをゆっくりと押しながら、roone溶液または溶媒を投与します。完了後、ゾンデをゆっくりと抜き、1つのケージ内のすべての個体の処置が終わるまで、動物を別のケージに戻します。処置後、マウスに4%パラホルムアルデヒドを心腔内投与して灌流固定します。

PBS中で腸管を解剖により摘出し、15% sucroseに一晩浸します。翌日、組織を30% sucroseに移し、4°Cで再び一晩インキュベートします。その後、組織を-80°Cのフリーザーに入れて使用時まで保存します。クライオスタットを用いて、腸管を20 micronの厚さで切片化します。

切片をfrostスライドに転写し、ブロッキングおよび免疫染色の手順を行います。次に、抗β3-tubulin抗体および抗α-synuclein抗体を用いて染色を行います。なお、データの解析は、外部の第三者が盲検法で行うことを推奨します。

解析を開始するために、Fijiソフトウェアを開きます。共焦点画像ファイルを開いてください。次に、各チャネルを個別に処理できるように、チャネルを分割します。

使用しないチャネルを閉じ、選択、解析、設定、スケール調整を行い、ピクセルサイズを1に設定します。既知の距離を0.13に設定し、「global」をクリックします。これで、画像のサイズがマイクロメートルで表示されます。

alpha synucleinチャネルを選択し、神経節を選択します。その際、すべてのスライスにおいて選択範囲が神経節を囲んでいることを確認してください。神経節のみが選択された状態で画像を複製すると、神経節と同じサイズの画像が複製されます。

編集（edit）を押し、クリア（clear）を選択すると、選択領域外の画像部分が黒くなります。手順が適切に完了したかを確認するために、再度画像を複製してください。S/N比（信号対背景ノイズ比）が低い画像は、画像解析に使用しないでください。

「Image」から「Adjust Threshold」を選択します。次に「Max Entropy」を選択します。その後、クロップ後の画像と元の画像の各スライスを確認し、処理が適切に行われたかを確認してください。

tropic thresholdにより、画像ヒストグラムに基づいた強度信号レベルを選択します。これにより、この閾値よりも強度の高いピクセルのみが、黒背景に白で表示される画像選択プロセスに抽出されます。次に、「smooth」をクリックします。このステップにより、画像のピクセル化されたエッジが滑らかなエッジに変換される画像選択プロセスが行われます。

次に、「binary」をクリックし、「Make binary」を選択します。画像が白地に黒の画像として表示されます。複製された画像を用いて次のステップを行うには、「analyze」をクリックし、「analyze particles」を選択します。その後、「show outlines」を選択し、「summarize」をクリックしてください。

その他の設定はデフォルトのままにしてください。この機能では、シグナルを持つ全ピクセル数と、それらが集まって構成されるシグナルを持つピクセルの総表面積を認識します。さらに、ピクセルのグループ数と平均サイズが報告されます。

適切に調整されており、総面積が最大のスライスを比較して選択します。そのスライスにマークを付けます。総alpha synuclein表面積、インクルージョン数、および平均粒子サイズのデータテーブルをコピーしてください。

データをExcelスプレッドシートに貼り付けるか、別の場所にメモしてください。Fijiに戻ります。beta tubulinチャネルで previously selected slice を探し、それを選択します。

神経節領域を選択し、[analyze]（解析）をクリックします。次に [measure]（測定）を選択してください。神経節の総表面積を示す別の表が表示されます。

表からデータをExcelスプレッドシートに抽出し、α-synucleinの測定値付近に配置するか、Excelを使用して別の場所にコピーします。α-synucleinの測定で得られた各パラメータを神経節の表面積で除し、神経節サイズで正規化した総α-synuclein表面積および封入体数を算出します。腸管神経系に局所的に作用するrotenoneの効果を分析するため、1歳のC57BL/6マウスに殺虫剤rotenoneを5 mg/kgの用量で経口投与しました。ここに示すクロマトグラムは、投与1時間後にrotenoneのピークが存在することを示しています。対照群として、rotenoneを20 mg/kgおよび5 mg/kg投与したマウスを用いました。

血液、脳および脳幹抽出液中のロテノン濃度を、ここに示すようにHPLCで測定しました。ロテノンを5 mg/kgで経口投与しても、HPLCによる測定では、投与1、2、または3時間後の血液中に測定可能な濃度は認められませんでした。このグラフは、投与したマウスの脳および脳幹におけるロテノン濃度を示しています。

10 mg/kg以下のロテノン抽出物を投与して1時間後、脳および脳幹サンプル中にロテノンは検出されませんでした。投与1時間後、1.5ヶ月間処置したマウスの筋肉および脳サンプルにおいて、ミトコンドリア複合体Iの活性を評価しました。群間に有意な差はなく、ミトコンドリア複合体Iの抑制も見られなかったため、これらの領域にロテノンが存在しなかったことが確認されました。

rone投与後のパーキンソン病のレビー小体成分であるalpha synucleinの解析により、alpha synucleinの総表面量、alpha synuclein封入体の存在、および細胞内におけるalpha synucleinのパターンの確実な決定が可能になります。この図は、ここに見られるように、十二指腸および回腸切片におけるanti beta three tubulin、alpha synuclein、およびDAPI染色の結果を示しています。roach knownによる1.5ヶ月間の処置により、3ヶ月間のコントロール群と比較して、腸管神経系神経節内のalpha synucleinの点状パターンの増加が誘導されました。

このパターンは回腸と十二指腸の両方で観察できます。3ヶ月間の治療後、抗alpha synuclein抗体を用いた免疫蛍光染色により、より大きなalpha synuclein封入体の形成が確認されます。また、theof、flavin、およびDPIを用いた解析では、3ヶ月時点で初めてより大きなalpha synuclein凝集体の集積が認められます。この実験では、自動セグメンテーションおよびエントロピーベースの閾値処理法を用いて解析を行いました。

左側のグラフでは、各列は神経節表面に対する総alpha synuclein表面積を表しています。右側のグラフでは、各列は採取された神経節表面あたりの総alpha synuclein封入体数を表しています。これらのデータから、ロテノンを局所投与することで、腸管神経系神経節においてグリオシスを伴うalpha synucleinのリン酸化、蓄積、および凝集が誘導されることが示唆されます。この手法に習熟し、正しく実施できれば、動物1匹あたり1分で完了させることができます。

本手順を実施する際は、ゾンデをゆっくりと挿入させることが重要であり、もし抵抗がある場合は、一度抜いてから再度これらの手順に従って挿入してください。また、HPLC、免疫染色、画像解析などの他の手法も併用可能です。これにより、他の領域の解析や、物質の効果、あるいは投与後の血液中における物質の存在を確認することができます。

この手法により、神経科学者が腸管神経系に対する環境神経毒の影響を調査する道が開かれました。このビデオを視聴後、ゲージを正しく適用し、免疫化学によって得られた画像を解析できるようになるはずです。腐敗したものを取り扱う際は非常に危険であることを忘れないでください。

したがって、本手順の実施中は手袋およびマスクを着用することを推奨します。