3の幼虫分節神経の可視化 ^RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

幼虫の分節神経を可視化することで、軸索輸送を研究することができます。3齢のdrosophilaを用います。まず幼虫を解剖し、視覚葉、腹側神経節、および分節神経を損傷させることなくCNSを露出させます。

手順の第2ステップでは、一次抗体で一晩、次いで二次抗体で暗所で1時間インキュベートする前に、lavaをホルムアルデヒドで固定します。その後、lavaをガラススライドに封入し、軸索輸送の欠損、タンパク質の局在、およびタンパク質の分布を免疫蛍光顕微鏡で観察します。

この手法は軸索輸送に関する洞察を得るのに有用ですが、シナプスや筋肉の形態などの他の系にも適用可能です。一般的に、この手法に慣れていない方は、許容される範囲内での解剖、特に脳の分節神経と筋肉を損なわずに維持することが当初は困難であるため、苦労すると思われます。本手順を開始するために、1倍の解剖用バッファー固定液、1倍のPBT、および5% BSA溶液を準備してください。

解剖前に提示した表に従い、5番のピンセット1組、直線刃のファンシザーズ1組、およびピンを準備して解剖を開始します。マイクロスポーンを使用して、特定の遺伝子型を持つ3齢幼虫をペトリ皿に回収します。次に、脱イオン水を満たしたペトリ皿で幼虫をすすいで洗浄し、すべての餌を取り除きます。

次に、ラバを背面にした状態でSガードディッシュ上に置きます。ラバの前端と後端をピンで固定します。最後に、細い鋏を用いて、固定したラバの上に1回使い切りの解剖バッファーを1滴滴下します。

後端近くの背側正中線にある幼虫を挟みます。はさみを使用して、後端から前端にかけて幼虫の角質層を切断します。切断した幼虫の上に、1倍の解剖用バッファーを1滴滴下します。

ピンを使用して、幼虫の中央付近にある角質層の側縁の一方を持ち上げ、別のピンで固定します。角質層のもう一方の側縁に対しても同様に行い、図に示すように各側縁に2本ずつピンを刺します。次に、腸、脂肪体、および気管を慎重に取り除き、2つの視葉と腹側神経節を持つ脳のみを残します。

分節神経を固定した状態で、ガードディッシュに装着した幼虫を用いて固定および抗体染色を行います。解剖した幼虫を50 µLの固定液に入れ、30分間インキュベートします。固定後、15分ごとに固定液を交換し、1倍PBTで30分間洗浄します。

10分ごとにバッファーを交換しますが、その際、幼虫が常にバッファーに浸っている状態を維持することが重要です。5%BSA溶液を用いて、一次抗体溶液を適切な濃度に希釈して調製します。最適な濃度は、使用する抗体によって異なります。

プラスチック製ディッシュに水で浸したKimwipeを敷き、加湿チャンバーを構築します。PBTを1回行うごとに、最後の一枚を交換してください。

調製した一次抗体溶液で洗浄し、加湿チャンバー内にて4 °Cで翌日まで一晩インキュベートします。解剖した幼虫を1× PBTで30分間洗浄し、その際10分ごとにバッファーを交換します。二次抗体を5%BSA溶液で適切な濃度に希釈し、調製します。

一部の二次抗体は光に敏感であるため、加湿チャンバーをアルミホイルで包みます。幼虫を二次抗体溶液とともに25 °Cで1時間インキュベートします。二次抗体によるインキュベートが完了したら、1×PBTで30分間幼虫を洗浄します。この際、10分ごとにバッファーを交換してください。その後、解剖した幼虫をスライドにマウントし、可視化します。

図に示すように、カバーグラスを置くのに十分な間隔を空けて、スライドの中央にネイルポリッシュで2本の垂直線を引いて準備します。ネイルポリッシュが完全に乾くまで待ちます。この画像に示すように、スライド上の垂直なネイルポリッシュの線の間のスペースに、封入バッファーを1滴滴下します。

これでスライドの封入準備が整いました。最後の個体がPBTの時間を経過した後、幼虫を回収します。洗浄し、幼虫から側方ピンを慎重に取り除きます。

キューティクルを破らないよう慎重に扱ってください。残りの2本のピンを抜き、ピンセットで幼虫を拾い上げ、準備したスライドガラスの上に置いてください。幼虫が反転せず、腹側を向いていることを確認してください。

スライドを上に向けて、そっとカバーガラスを載せ、ここに示すように端をマニキュアで封印します。これで、蛍光顕微鏡下で幼虫を観察する準備が整いました。この代表的な画像は、シナプス小胞タンパク質であるcysteine string proteinに対する抗体で染色した野生型幼虫のものです。

lava分節神経は均一に染色されています。ここでは、モータータンパク質変異体lavaをCSP抗体で染色しました。分節神経には、CSPが強く染色される大規模な蓄積が見られます。

この手順を行う際は、脳に接続している分節神経を保持し、筋肉を損傷させないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、解剖方法について十分な理解が得られるはずです。免疫染色を固定し、蛍光顕微鏡を用いて軸索輸送を研究するために、幼虫の分節神経の作製を開始してください。