ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

この手順の全体的な目的は、神経系のホールマウント可視化に向けて、ophおよびmelanogasterの胚を調製することです。まず、目的のショウジョウバエ系統から胚を回収します。次に、漂白剤を用いて卵膜を除去します。

手順の第3段階では、ヘプタンとメタノールを用いてビリン膜を除去します。手順の最終段階では、胚に抗体を適用します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を通じて、ショウジョウバエ胚の神経系の構造を示す結果を得ることができます。

この手法は、神経系が発達する過程において変異がどのような役割を果たすかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に慣れていない方は、バイアルから胚を誤って吸い出してしまうことがあるため、習得に苦労する可能性があります。まず、P-E-M-F-A、0.01%アジ化ナトリウムを含む5%BSA含有PBC緩衝液、およびホルムアルデヒド固定液を含む、必要な試薬を準備してプロトコルを開始してください。

二酸化炭素でフライを昏睡させ、リンゴジュースアガー餌用プレートを備えたアダプター付きプラスチックボトルに少なくとも100匹のフライを移し、目的のショウジョウバエ系統の飼育ケージを準備します。フライのケージを室温の暗所に72時間置きます。フライがケージに慣れ、実験のために産卵を抑制することがないよう、8〜12時間ごとにリンゴジュースアガー餌用プレートを交換してください。

72時間の馴化期間の後、リンゴ汁寒天餌プレートの最終交換から12時間後に胚を回収します。産卵ケージからリンゴ汁寒天餌プレートを取り出し、生理食塩水を用いて交換します。リンゴ汁寒天餌プレートを洗浄してください。

胚を細かい篩で回収します。清潔な絵筆を使用して、プレートに付着して残っている胚を剥がしてください。篩の中の胚を生理食塩水で洗浄して過剰な酵母を除去し、スパチュラを用いて胚をそっとすくい上げ、小さなガラスバイアルに入れます。

生理食塩水を約1 mL加えます。その後、バイアルのキャップを閉め、胚を洗浄するために5分間インキュベートします。これにより、胚の回収が完了します。

50% ヘプタンと 50% 固定液を混合して、ヘプタン固定溶液を調製します。この溶液は、上層にヘプタン、下層に固定液が層をなして分離します。5分経過後、パスタピペットを使用して、胚が入ったガラスバイアルから過剰な生理食塩水を抜き取ります。

胚が入ったガラスバイアルに脱イオン水を約1mL加え、胚をすすぎます。1分間静置した後、水を抜き、50%漂白液を加えます。バイアルを手で数回振り、胚をコーティングするために3分間インキュベートします。

処理した胚はバイアルの底に沈みます。胚のCORは浮上します。3分間のインキュベーション後、漂白剤とCORを除去してください。

デコーレーション後、胚が入ったガラスバイアルに脱イオン水を約1 mL加え、胚を十分に洗浄します。1分間静置した後、水を排します。残ったCORは浮上するため、これらを除去してください。その後、ヘプタン固定液を胚に加え、緩やかに振盪しながら30分間インキュベートして固定します。

パスタピペットを使用して、下層にある固定液を除去し、チューブ内にヘプタンを残します。次に、固定液の代わりにメタノールをチューブの底部に添加し、キャップをして手で激しく振ることで、卵黄膜を除去します。この操作の後、処理された胚はチューブの底に沈降します。

パスタピペットを用いて、バイアルからメタノールとヘツを除去し、脱イオン化された胚のみを残します。その後、胚をメタノールで5回洗浄し、各洗浄の間にパスタピペットでメタノールを除去します。各洗浄において、胚を5分間インキュベートしてください。

胚を50% PBT溶液と50% メタノールの混合液に5分間浸し、再水和させます。続いて、100% PBT溶液に移して5分間置くことで、再水和プロセスを継続します。次に、0.01% アジ化ナトリウムを含む5% BSA溶液中で、4°Cで1時間インキュベートし、胚をブロッキングします。

次に、0.01%アジ化ナトリウム含有5%BSA溶液を用いて一次抗体を適切な濃度に希釈し、胚染色のための一次抗体を調製します。ここでは、小胞性システインストリングタンパク質に対する抗体およびanti-HRP抗体を使用します。Anti-HRPは表面糖タンパク質に存在する神経特異的な糖鎖部位を認識し、すべてのニューロンを標識します。

胚を一次抗体溶液中で4 °Cにて一晩インキュベートします。1時間かけて、PBTで胚を10回洗浄します。胚が入ったガラスバイアルに約1 mLのPBTを加え、6分間静置してからPBTを除去します。

PBTの塗布、インキュベーション、およびPBTの除去というこの工程を10回繰り返します。二次抗体溶液は光に敏感であるため、適切な濃度に希釈して暗所で調製します。ここでは、Alexa二次抗体を1:200の濃度で使用します。

胚を二次抗体溶液中で、4 °Cで2時間インキュベートします。光への曝露を避けるため、胚と二次抗体溶液が入ったガラスバイアルをアルミホイルで包みます。1時間かけて、PBTで胚を10回洗浄します。

胚にVector Shield封入剤を加え、4 °Cで一晩インキュベートして封入します。パステルピペットを用いて、封入剤とともに胚を吸い上げます。胚と封入剤をガラススライドに載せます。

胚の上にカバーガラスを掛け、ネイルポリッシュでカバーガラスを密封します。ここで、蛍光顕微鏡を用いて胚を観察します。ステージ16から17の胚の中枢神経系（CNS）が示されています。

シスチンストリングタンパク質を赤色で、HRPニューロンを緑色で示しています。この代表的な画像において、交連部が明確に染色されていることに注目してください。

胚性のPNSがステージ16から17に示されています。ここでも、cystine string proteinが赤色で、ニューロンが緑色で示されています。末梢ニューロンの反復パターンに注目してください。

この手順を行う際は、胚を誤ってバイアルから取り出さないよう、十分に注意することが重要です。このビデオを視聴することで、神経系のホールマウント可視化に向けた oph fla 胚の調製方法について、十分に理解できるはずです。