DNAフラグメントをElectroeluting

こんにちは。本日は、制限酵素消化産物やPCR産物などのDNA断片を精製するために行われるエレクトロルーション（電気溶出）の手法をご紹介します。クローニングやシーケンシングなどの後続の目的において、エレクトロルーションは有効な手法の一つです。DNAが負に帯電している性質に基づき、電場内に高密度の障壁を設けることで、断片を停滞させ、それ以上の移動を防ぎます。

この手法により、さまざまなソースから幅広いサイズのDNA断片を、最大80%という比較的高い効率で精製することが可能です。他の精製方法（カラムやレジンキットなど）と比較して、低コストであることも電気溶出の利点です。まず、精製したい目的の断片を可視化し特定するために、臭化エチジウム染色したアガロースゲル電気泳動によってDNAサンプルを可視化し、電気泳動を行います。

断片が十分に分離されていれば、サイズが小さい断片でも正確に決定できます。電気泳動後、新品のカミソリ刃を用いて、目的のバンドにできるだけ近づけてゲルスライスを切り出し、目的の断片を丁寧に回収します。

この手順は、適切な紫外線遮断対策を講じ、手袋を着用して行ってください。電解溶出装置に適切な溶出バッファーを満たし、中央プラトーの表面に液体が行き渡るように注意した後、ゲルスライスをホイールの1つに入れ、Vチャンネルにできるだけ近づけて配置します。Vチャンネル内に気泡がないことを確認してください。

バッファーでチャネルを洗浄して閉じ込められた気泡を除去することで、これを回避できます。次に、ウェルに近い側からVチャネルに100 µLの高塩濃度バリアを注意深く加えます。チャンバーを密閉し、電極を電源に接続して、100～120 Vで電気溶出を開始します。

タイムラプス時間はフラグメントのサイズに依存し、最大 20 kb までの大きなフラグメントの場合は 50 分から 1 時間で十分であると考えられます。小さなフラグメントの場合は、塩溶液を通過して最終的なバッファーチェーンへさらに溶出することを避けるため、UV ライトを用いて 10 分ごとにモニタリングする必要があります。本例では、ND one および entry の酵素を用いて 560 ng のプラスミドを消化し、900 bp のフラグメントを遊離させました。これは、サンプル 84 ng に相当します。

したがって、ゲルのスライスをウェル内に配置した後、100 Vで25分間電気溶出を行います。電気溶出が完了し、DNA断片がVチャネル内のサウスクッションに捕捉されたら、レセプタクロの遠位側からチャネル内の溶液400 µLを回収し、マイクロピペットに取り付けたファインチップを用いて1.5 mLマイクロチューブに移します。そこに2倍量の冷絶対エタノールを加えてボルテックスで混合し、アルコール沈殿を行います。さらに、DNA回収率を向上させるために2〜3 µLのグリコーゲンを添加しても構いません。チューブを-20 °Cで1時間、あるいは一晩保存した後、4 °Cで最大速度にて25分間遠心分離します。

この上清および洗浄液に、冷やした70% ethanolを1 mL加え、4 °Cで最大速度にて5〜10分間遠心分離します。上清を捨て、チューブを逆さまにした状態で室温で乾燥させます。その後、nuclease-free water 10〜15 µLで再懸濁し、サンプルの濃度測定に進みます。本例では、精製したサンプルを水10 µLで再懸濁し、分光光度計を用いて波長260 nmで定量した結果、濃度は6.3 ng/µLであり、回収率は75%でした。貴重な時間をわずか10分だけ投資して、キットを使用した方が効率的だと考えるかもしれません。

しかしながら、このプロセスに時間を要するものの、多くの変数を制御できるため、サイズや由来が異なるより広範なサンプルを精製することが可能になります。本例でご覧いただいたように、ほとんどのDNA精製キットと同等またはそれ以上の75%という回収率が確認されました。本日はご視聴いただきありがとうございました。

このプロトコルが皆様の研究プロジェクトに役立つことを願っております。