蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

本実験の目的は、新規のflu genic DNA Zymeプローブを用いて、大腸菌（e coli）などの特定の細菌の存在を迅速に検出することである。まず、ライゲーションによってgenic DNA Zymeプローブを作製する。次に、細菌を培養して標的分子の数を増やし、その上清から細胞外混合物を調製する。

次に、粗抽出した細胞外混合物をDNAザイムプローブと混合します。DNAザイムプローブと標的分子との相互作用によってプローブが切断され、蛍光を発します。フルオリメーターを用いて、プローブと標的の相互作用を相対蛍光強度の増加として検出します。その後、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて結果を検証します。

この手法のPCRや抗体ベースの手法に対する主な利点は、手順がより簡便で実施しやすいことです。本手法はモデル細菌であるe coliを用いて開発されましたが、その他のあらゆる食品由来または院内感染の原因となる細菌病原体の検出に適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、合成DNAプローブや細菌の取り扱いに慣れていないため苦労することがあります。本プロトコルの手順を実演するのは、私の研究室のリサーチアシスタントであるSergio Aguireと、ポストドクターのMonso Aliです。

R-F-D-E-C 1は、注目すべきDNA Zymeです。これは、黒線で下線が引かれた触媒配列EC 1と、緑線で下線が引かれた基質配列FS 1で構成されています。基質内には、青色のrで示されるRNAリンカーが含まれており、Fで示されるフルオロラベル付きDTと、Qで示されるクエンチャーラベル付きDTに挟まれています。RF SS 1はRFD EEC 1のスクランブル版であり、触媒配列EEC 1は部分的にSS 1へとシャッフルされていますが、FS 1部分は変更されずに維持されています。RF DEC 1およびRF SS 1は、オリゴヌクレオチドFS 1をオリゴヌクレオチドEC 1またはSS 1と、ライゲーションテンプレートとしてLT 1の存在下でテンプレート媒介酵素ライゲーションを行うことにより作製し、R-F-D-E-C 1の標的として使用する粗抽出液（CEM）を調製します。まず、ピペットガンを用いて、滅菌済みの14 mL培養チューブに2 mLのLBを分注することから始めてください。

次に、滅菌済みのピペットチップを用いて、アガープレートからe coliの単一コロニーをピックアップし、LBを含む培養チューブに投入します。チューブを37 °Cに設定したインキュベーターに入れ、14時間の培養後、250 RPMで振盪します。1%の接種培養液を作成するために、14 mLの培養チューブに2 mLの新鮮なLBを分注し、前ステップで得られた細菌培養液を20 µL加えます。

各細菌溶液のOD 600が約1.0になるまで、37 °Cで250 RPMで振とう培養します。各培養液を1 mLずつ新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、11,000 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離後、透明な上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

上清を-20°Cで保存します。DNA酵素と粗細胞抽出液の相互作用によって蛍光信号が発生するかを直ちに確認しない場合は、分光光度計を用いてサンプルを分析します。蛍光分光光度計の電源を入れ、励起波長を488 nm、蛍光波長を520 nmに設定してデータ収集パラメータをセットアップします。

また、装置を1時間にわたって1分ごとに測定を行うよう設定します。3つの石英結晶キュベットを、まず脱イオン蒸留水で洗浄し、次に100% ethanolで洗浄します。キュベットを窒素ガスで吹き付けして乾燥させます。

キュベットに、コントロール1用としてC1、コントロール2用としてC2、テスト用としてTのラベルを貼ります。次に、C1に24 µLの蒸留脱イオン水を、C2とTに調製したE. coli粗細胞外混合液を24 µLずつ分注します。各キュベットに25 µLの2 X RBを加え、蛍光分光光度計に設置します。5分後に蛍光データの収集を開始し、蛍光測定を中断させないように注意しながら、C2に5 µMのRFS S1を1 µL、TとC1に5 µMのRFD eec1を1 µLずつ加えます。ピペッティングで各溶液を混合し、データ取得期間の終了まで反応を継続させます。

データをExcel形式で保存します。その後、データをパーソナルコンピュータに転送し、Excelを使用してグラフ画像を作成します。Spectraによる分析に使用したものと同じ反応混合物を使用してください。

光度計を用いてゲル電気泳動による解析を行うことができます。1時間の測定後、分光光度計からキュベットを取り出し、溶液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

3 M 酢酸ナトリウム 5 µLと100%エタノール 125 µLを加えて反応を停止させます。各溶液をボルテックスで混合し、インキュベーション後、チューブを-20 °Cのフリーザーで1時間静置します。反応混合物を4 °C、11,000 Gで20分間遠心分離し、ピペッティングで慎重に上清を除去します。

DNA濃縮器を用いて、ペレットを10分間乾燥させます。ゲルロード用バッファーを20 µL加え、短時間ボルテックスします。ベンチトップ遠心機で短時間スピンダウンします。

次に、泳動後、10%Dageゲルの各ウェルに反応サンプルを10 µLずつロードします。ガラスプレートを取り外し、水道水で十分に洗浄します。ゲルの破片を取り除くため、キムワイプでプレートを拭きます。

Typhoonスキャナーを用いて、ゲルプレートの蛍光をスキャンします。得られた画像を画像定量ソフトウェアで解析し、システムの感度を評価します。段階希釈した培養物を、時間を変えて培養します。

単一の細菌を検出するために必要な最小インキュベーション期間を決定するため、2 mLのLB培地を含む10本の培養チューブを準備します。各培養物に、2 CFU/mLに調整したE. coliのグリセロールストックを100 µLずつ接種し、37 °C、250 RPMの振盪条件下で4、8、12、16、および24時間インキュベートします。接種した各培養チューブから300 µLを回収します。なお、4、8、12時間の時点で回収したサンプルでは、検出可能な細菌が存在しない可能性があります。

残りの培養液を24時間培養し、細菌を含む培養液を特定します。OD 600を測定し、11,000 Gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。CEMSを含む上清を新しい1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、翌日に使用するまで-20 °Cで保存します。

培養液の増殖を確認します。接種後、10本の培養液のうちe coliが含まれるのは1本または2本のみであり、残りのチューブには細胞は含まれません。指定された時点で陽性培養液から回収したCEMSを使用します。RFD EEC oneを用いた切断反応を準備し、前述のDAGEゲル電気泳動を用いて反応混合物を分析します。RFD EEC oneおよびRF SS oneの両プローブは、DNA zyme部分を基質に酵素的にライゲーションさせることで調製されました。

CEM EECとRFD EEC、またはRF SSの相互作用を分光法により評価しました。ここで示されているように、CEM ecの添加により、RFD EECから高レベルの蛍光信号が検出されました。

対照的に、R FS S oneは強い蛍光信号を示しませんでした。したがって、CEM ECと接触した際のRFD EEC oneの蛍光産生機能が配列化されます。

観察された蛍光強度の増加がRNAリンカーの切断によるものであることを確認するために、特異的な検証を行いました。反応混合物を分析しました。RFD eecのdage切断において、0.25 Mの水酸化ナトリウムによる処理では、5'末端にフルオロフォアを保持する断片と3'末端にクエンチャーを保持する断片という2つのNA断片が生成されることが予想されます。ここに見られる通りです。

RFD EEC CEM EEC反応混合物により、期待通りの切断産物が実際に生成されました。さらに、UNCのみがR-F-D-E-Cを切断し、5'端フラグメントが蛍光イメージングで検出されました。RFD EECの特異性を検討するため、他のいくつかのグラム陰性菌およびグラム陽性菌からのみ回収したCEMSを用いて蛍光アッセイを実施しました。

CEM ECを含むサンプルでは、蛍光の増加が認められました。他の細菌由来のCEMSとの交差反応が見られなかったことは、R-F-D-E-C oneがE. coliに対して高い選択性を持つことを示しています。単一のE. coli細胞を検出するために必要な最小培養時間を決定するため、E. coliを100 µLの増殖培地中で1 CFU/mLに希釈し、4、8、12、16、および24時間培養しました。得られたCEMSをR-F-D-E-C oneと混合し、ここに示すようにdageを用いて切断を評価しました。

Dageアッセイの画像から、R-F-D-E-C 1では期待された切断産物が生成されなかったことが示されています。CEMと反応させた際、培養4時間後および8時間後に回収したECSでは、習熟後に12時間の培養時間が必要であることが示されました。

この手法の重要な構成要素は、適切に実施されれば、DA酵素ベースのアッセイを60分で完了できる点にあります。この開発により、バイオ分析分野の研究者が、広範囲にわたる細菌病原体を検出するためのアロゲニックDNA酵素を探索するための道が開かれました。