キネマティクスと床反力の測定：ヤングアダルト、中年、そして老年ラットの運動能力を定量化するデモンストレーション

このビデオでは、自由行動下のラットにおける床反力と後肢キネマティクスの測定手順を実演します。まず、ラットに餌による報酬を与え、ランウェイを安定して横切るように訓練します。その後、後肢の主要な解剖学的指標となる部位にリフレクティブマーカーを配置します。

動物が餌の報酬を得るために移動している間に、ビデオ録画と床反力データを収集します。反射マーカーをデジタル化し、データを遡及的に処理します。さまざまな疾患モデルのラットにおいて、運動能力の定性的および定量的な差異が観察されます。

こんにちは、オーブリー・ウェブです。私はカナダのアルバータ州カルガリーにあるカルガリー大学の獣医学部およびホッチキス脳研究所の助教授を務めております。歩行評価スケールやその他のエンドポイント測定法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、歩行するラットの群間におけるわずかな差を区別するのに役立つ、感度が高く客観的な定量的データを提供できる点にあります。

この手法は、潜在的な治療薬の効果など、神経科学および整形外科分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術は、実際には効果があるにもかかわらず「効果なし」と判断される可能性が低いため、さまざまな疾患モデルの治療への応用が期待されます。本手法を用いることで、ラットの運動能に関する知見を得ることが可能です。

また、さまざまな動物種における神経疾患や整形外科的疾患の多様なモデルなど、他のシステムにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、バイオメカニクス解析に多大な時間と忍耐が必要であるため、習得に苦労することがあります。また、データ解析のトラブルシューティングには高度なバイオメカニクスの知識が求められます。本手法は数十年にわたり複数の種で使用されてきましたが、市販の装置が登場したことで、最近になってようやくげっ歯類への適用が可能となりました。ラットの運動能を測定する最初のステップは、各個体に囲いのある平坦なランウェイを横切るように訓練することです。

適切な動物供給業者からラットを受け取ったら、新しい飼育環境に慣れさせる必要があります。期間は1週間とします。この馴化期間中、ラットのケージにCheeriosを数粒入れてください。

肥満を防ぎ、その後のタスクに対する意欲を確保するため、動物には維持エネルギー量に制限した食事を毎日与えます。1週間、毎日同じ時間帯に各動物を10〜15分間ハンドリングし、ランウェイの両端にCheeriosを配置して各動物を中に入れます。動物が環境に慣れると、Cheeriosを食べ始めます。

動物がランウェイ内でチリオスを食べることに慣れたら、餌の報酬を得るためにランウェイの全長を走るようオペラント条件付けを行う必要があります。これは、ラットがいる位置とは反対側のランウェイの端に、4分の1個のチリオスを投げ入れることで行います。ラットがこのチリオスを食べたら、ランウェイのもう一方の端に再び4分の1個のチリオスを置きます。

ラットがギャロップやバウンディングをすることなく、一定の速歩速度でランウェイ上を安定して移動してチェリオを食べられるようになるまで、これを繰り返します。このタスクに対する動物の条件付けが進みすぎると、ギャロップやバウンディングの歩様が誘発されることがあり、これらはバイオメカニクス的な解釈がより困難になります。それでは、関節位置のマーキングの手順を確認しましょう。

四肢にスキンマーカーを貼付すると、激しく屈曲した姿勢とそれに伴う皮膚の移動アーチファクトが生じるため、肢のキネマティクス解析の信頼性が低下します。そのため、前肢のキネマティクス解析には、X線シネマトグラフィまたは透視撮影を用いる必要があります。したがって、本ビデオでは後肢の関節位置マーカーの貼付方法のみについて説明します。

動物を麻酔した後、後肢および背側を腸骨稜の高さまで除毛します。次に、動物を腹臥位に置き、無毒性の油性マジックを使用して、固定用フォームで支持しながら後肢をほぼ直立した状態に配置し、以下の部位に印を付けます。腸骨稜の最も頭側の部分、大腿骨の大転子、脛骨外側結節、足根関節、および第5中足骨の遠位外側。

ラットは自然なグルーミング行動によって徐々にマーカーを落としてしまうため、 previously marked した解剖学的指標を毎日強調し直す必要があります。次に、データの記録方法を確認しましょう。キャリブレーション用の容量物をランウェイの所定のエリア内に配置します。

各カメラから、ランウェイ内のキャリブレーションボリュームのシングルフレームをキャプチャします。録画セッションを開始する前に、各カメラのビューを確認してください。4台すべてのカメラで視野が同一であること、および視野の中心にフォースプレートが含まれ、2歩分のストライドをキャプチャするのに十分な長さのランウェイが含まれていることを確認してください。

各ポールの長さに沿ったすべての校正マークをデジタル化します。この校正ステップは、データ収集前に行う非常に重要な工程です。校正が正確に行われなかった場合、あるいは記録セッションの直前に行われなかった場合、得られるすべてのデータは不正確となり、使用できなくなります。

デジタル化において満足のいく誤差範囲が達成された後、動物をランウェイに配置する直前に、移動データの収集に進みます。体重を記録し、後肢の地形的ランドマークに事前に付けたフェルトマークに合わせて、円錐形の反射スキンマーカーを貼付します。後肢にマーカーを配置したら、コンピューターの前に座り、Viconモーターシステム経由で接続されたイベントマーカーを準備してください。

校正済みファイルをテンプレートとして使用し、記録を開始する前に複数のファイルを作成します。通常、十分な回数のラン（包含基準）および速度を収集するために、25から30個のファイルが必要となります。ファイルが作成されたら、データの収集を開始してください。

まず、慎重な調整とタイミングでランウェイの両端にCheeriosを4分の1個ずつ投げ、ラットがランウェイ内を往復するように促します。イベントマーカーは、開始時およびラットがランウェイを正常に通過する直前にトリガーされます。粗い床反力波形を確認し、左右どちらの肢がフォースプレートに接触したかを記録した後、ファイルを保存して閉じます。

左右それぞれの肢によるフォースプレートへの接地回数が同数記録されるようにします。十分な回数のランが記録されるまで、あるランからのデータ記録プロセスを繰り返します。それでは、キネマティクスと床反力のデータ収集が完了した後、ランのデータをどのように分析するかを確認しましょう。すべての動物の各ランについて、Vicon Modusソフトウェアと2つの相対的に固定されたマーカーを用いて速度を評価する必要があります。

例えば、回腸翼を用いてマーカー間の仮想点を評価することができます。これにより、この仮想点の水平方向の速度を算出することができ、動物が秒速 60 から 90 cm の範囲で移動しているランのみを抽出します。解析には、最低 10 回のランが必要です。

左肢がフォースプレートに接触する試行を5回、および右肢がフォースプレートに接触する試行を5回行います。各動物について許容可能な試行が特定されたら、皮膚の動きを補正するために、残りのスキンマーカーのデジタル化を完了させる必要があります。膝位置のアーティファクト推定は、三角測量、および股関節、膝、H関節の角度を用いて算出されます。

速度と加速度を決定し、立脚相および遊脚相の時間も評価することが可能です。同時に収集された床反力データを同じソフトウェアを用いて解析することで、互いに直交する3方向における力に関するさまざまな変数を算出できます。同時に収集された床反力データを同じソフトウェアを用いて解析することで、互いに直交する3方向における力に関するさまざまな変数を算出できます。

次に、この形式の運動解析の有用性を示す代表的な結果を提示します。若年、中年、および高齢の雌ウィスターラットについて、キネマティクスと床反力を測定しました。この解析の結果、雌ウィスターラットにおいて加齢に伴う差異が認められました。

具体的には、床反力分析により、高齢ラットは4肢の制動能力が低下しており、他の動物群と比較して側方安定化のために後肢をより多く使用する傾向があることが示されましたが、キネマティクス分析では各群間に統計的な有意差は認められませんでした。これは、本手順を実施することで、実質的にあらゆる年齢のラットからキネマティクスを容易に記録できることを示しています。この手順に従ってデータを収集する際は、データ収集の直前または直後に動物の体重を測定し、データ収集前にシステムを慎重にキャリブレーションすることが重要です。

全個体を用いた臨床電気生理学などの他の手法を用いることで、さらなる疑問を解消することが可能です。例えば、キネマティクスや床反力の知見は、神経再生に関連しているのか、あるいは末梢神経再生などのより広範な神経解剖学的可塑性と関連しているのか、といった点です。このビデオを視聴することで、市販の装置を用いて、自由に行動するラットから床反力および後肢のキネマティクスデータを収集する方法について十分に理解できるはずです。