コラーゲンゲル含有する細胞のモジュールを使用してマイクロ組織の作製

本手順の全体的な目的は、組織工学の実験に使用可能なモジュール式マイクロ組織を作製することです。まず、シリンジを用いてコラーゲン溶液をポリエチレンチューブ内に吸引し、次にコラーゲンをゲル化させることでこれを達成します。第2のステップでは、ポリエチレンチューブを2 mmの長さに切断し、マイクロ組織モジュールを形成します。

手順の第3ステップでは、モジュールをチューブから分離し、最後にモジュールを内皮細胞でコーティングします。最終的に、得られたマイクロ組織は、マイクロ流体チャンバーを介して細胞間の相互作用を研究するためのin vitro細胞アッセイに使用できます。さらに、これらのマイクロ組織を移植することで、in vivoにおけるマイクロ組織の相互作用およびリモデリングを研究するための組織を構築することが可能です。

こんにちは。トロント大学Sepan Labのブレンダン・ロングです。大型の3D組織代替物を構築する際の大きな障害となるのが、移植後の迅速な血管新生の不足です。このビデオでは、この制限を克服するために、血管内皮細胞でコーティングされたモジュール式組織を作製する方法をご紹介します。

手順のデモンストレーションは、Septinラボの術後フェローであるChamberlainが行います。中和するコラーゲンの量は、ポリエチレンチューブの長さに依存します。このデモンストレーションでは、内径0.76 millimeter、外径1.22 millimeterの2メートルのポリエチレンチューブを使用します。

チューブを準備するため、20 Gの針をチューブの一端に挿入し、その後、チューブをガス滅菌用のコンバーター自己修復ポーチに入れます。1 mLのコラーゲンで約2 mのポリエチレンチューブが満たされるため、ここでは1 mLのコラーゲンを中和します。コラーゲンを15 mLコニカルチューブに入れ、チューブを氷上に保持します。

コラーゲン1 mLあたり128 µLの10x alpha-MEMをチューブに加え、ピペッティングを繰り返して混合します。気泡が発生しないよう注意しながら混合すると、酸性化したコラーゲンにalpha-MEMが混ざるにつれて溶液が黄色に変化します。次に、0.8 Mの炭酸水素ナトリウムを加えてコラーゲンを中和します。pHの概算として、黄色のコラーゲン溶液が薄いピンク色に変わるまで炭酸水素ナトリウムを加えます。

pH 7.4にするには、通常、コラーゲン1 mLあたり30～60 µLが必要です。中和したコラーゲンがゲル化するのを防ぐため、使用直前まで氷上に保持してください。コラーゲンをゲル化させる手順を開始するには、滅菌済みのポリエチレンチューブが入ったバッグをバイオセーフティキャビネットに運び、チューブをバッグに入れたまま、バッグの密封端を切り取ります。

滅菌済みのピンセットを使用して、チューブの一端に事前に挿入しておいた20ゲージの針に3 mLのシリンジを取り付けます。チューブのもう一端を、氷上に保持したコニカルチューブの底部に先端が届くまで、中和済みコラーゲンの中に挿入します。次の手順はゆっくりと行う必要があります。そうしないと、コラーゲンの中に気泡が混入してしまいます。

シリンジのプランジャーをゆっくりと引き、ポリエチレンチューブにコラーゲンを吸い込みます。コラーゲンがチューブを通過したら、20ゲージの針を引き抜き、チューブの両端をバッグに戻します。バッグをテープで密閉した後、37 °Cで60分間インキュベートします。

あらかじめ組み立てられた切断装置を使用して、チューブを切断します。この手順を開始するには、切断装置の前面にある滅菌トレーにチューブを置き、切断装置の出口からチューブをセットします。次に、25 mLの血管内皮細胞培地を入れた50 mLコニカルチューブを用意します。切断されたモジュールを回収するため、切断装置をチューブの長さ2 mmで切断するように設定し、チューブを切断します。

切断したモジュールを50 mLコニカルチューブに入れ、37 °Cで60分間インキュベートします。チューブからコラーゲンモジュールを取り出すため、モジュールが入った50 mLコニカルチューブを中速で10秒間ボルテックスします。その後、モジュールがチューブの底に沈殿するまで、約5分間静置します。

チューブの底にモジュールの緩いペレットが形成され、チューブは培地の上に層を作ります。モジュールが沈殿した後、口の広い10 mLセロロジカルピペットを使用して、それらを15 mLコニカルチューブに移します。15 mLコニカルチューブをボルテックスし、その後さらに2回、モジュールを沈殿させます。

2番目および3番目のボルテックスで沈殿したモジュールも15 mLチューブに移します。すべてのモジュールをチューブから取り出して回収した後、チューブ内の培地量を5 mLに調整します。これでモジュールが血管内皮細胞でコーティングされる準備が整いました。次に、モジュールのコーティングに使用する血管内皮細胞の調製方法について説明します。

まず、細胞から培地を除去し、PBSで洗浄します。PBSを除去した後、trypsin EDTAを3 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。次に、細胞を7 mLの培地で再懸濁し、15 mLチューブに移します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、コニカルチューブの底部にあるパックされたモジュール1 mLあたり5×10⁶個の内皮細胞を用意します。300 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。細胞ペレットを5 mLの内皮細胞培地で再懸濁します。

次に、血管内皮細胞を含む培地5 mLをモジュールに加えます。モジュールを血管内皮細胞と共に、静置および動的の両方の条件でインキュベートします。静置インキュベーションの場合、血管内皮細胞を含むモジュールを転倒混和し、その後、チューブを直立させて37 °Cで15分間静置します。15分後、再びチューブを転倒させ、37 °Cでさらに15分間インキュベートします。

内皮細胞を用いてモジュールを動的にインキュベートするため、15 mLチューブを37 °Cで60分間緩やかに揺らします。内皮細胞によるインキュベーションが完了したら、モジュールを非組織培養処理プレートに移し、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、未接着の内皮細胞を除去するため、モジュールを新鮮な培地 containing を入れた新しい非組織培養処理プレートに移します。内皮細胞でコーティングされたモジュールを、細胞がモジュール表面の100%を覆うまで37 °Cでインキュベートします。

通常、これには約7日かかります。チューブから取り出した直後のモジュールは円柱状に見えます。内皮細胞でコーティングされている場合、体積が最大50%まで収縮して楕円形になり、光学顕微鏡で観察すると密度が高まり、より不透明になります。

これらの画像において、モジュールの直径と長さはそれぞれ d および l で示されています。次の画像は、作製時にモジュール内に均一に分散した埋め込み Hep G2 細胞を示しています。生存細胞が緑色に染まっていることから、細胞が高い生存率を維持していたことが分かります。

内皮細胞が合流した際、死細胞は赤色に染まります。モジュールの表面にはタイトジャンクションが形成されており、これは免疫蛍光染色で確認できます。VE cadherinの染色および物質移動解析により、モジュールは、大型の組織でしばしば問題となる酸素輸送不足による壊死コアの形成を伴うことなく、高い細胞密度を維持できることが実証されています。

この例において、典型的な小型モジュールのマッソン・トリクローム染色では、作製から7日後もモジュール内に生存細胞が均一かつ高密度に分布して維持されていることが示されました。対照的に、大型モジュールの中心部では多数の死細胞が形成されており、生存細胞は薄い外縁部にのみ残っていました。また、コラーゲンと合成ポリマーの混合物を用いたモジュールや、薬剤放出性マイクロスフェアを含むモジュールも作製されています。

hhm EC1細胞をPLGA含有コラーゲンモジュールに播種した場合、モジュールは円筒形を維持しますが、コラーゲンのみのモジュールと比較して細胞付着性は限定的になります。ここでは、PLGAベースの生分解性マイクロスフェアを含むコラーゲンモジュールの光学顕微鏡画像を示します。いくつかのin vitroアッセイが、これらのモジュールと適合することが示されています。

例えば、血管新生アッセイにおいて、内皮細胞を播種したモジュール上に形成された毛細血管様構造は、脂肪由来幹細胞とともに5日間培養した後、容易に検出および定量することが可能です。別の例として、モジュール上での生存・死滅アッセイの共焦点顕微鏡像では、生存細胞が緑色に、死滅細胞が赤色に染色されて観察されます。さらに、これらのモジュールはマイクロ流体チャンバー内で使用されたり、マウスやラットに移植されたりしており、異なる細胞型間の相互作用や、ホスト反応によってマイクロ組織がどのように再構築されるかの研究にも利用されています。

この手順に従い、モジュールをペトリ皿や、バイオリアクター、マイクロ流体デバイスなどの他の容器で培養することができます。また、細胞種類の組み合わせを変更したり、異なる直径のチューブを使用したりすることで、この手法をさまざまな組織の作製に応用することが可能です。ご視聴ありがとうございました。