細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織
2016年7月10日
この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。
この手順の目標は、分岐形態形成に対する機械的ストレスの影響を決定するなど、多くの実験的状況で使用するために、コラーゲンゲルに埋め込まれた同一の三次元組織の隆起を設計することです。この方法は、集団細胞の挙動の根底にあるメカニズムの決定など、組織形態形成における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、人工組織の形状が制御され、再現性があり、物理的および生化学的要因の正確な操作と測定が可能になることです。
したがって、サンプルサイズは十分に大きいため、高い統計的信頼性で結論を出すことができます。まず、標準的なフォトリソグラフィー技術を使用して、目的のアレイでフォトパターニングされたシリコンマスターを調製します。このビデオで使用されているパターンは、200 ミクロン間隔で配置された長方形の構造で構成されています。
次に、プレポリマーと硬化剤を使い捨て皿に10:1の割合で組み合わせて、50gのPDMSを混合します。次に、混合物を15〜30分間真空下に置き、混合プロセス中に導入された気泡を取り除きます。シリコンマスターテクスチャ面を上にしてプラスチック製の計量ボートに置き、脱気したPDMS溶液を金型の上に注ぎます。
次に、皿をオーブンに入れ、PDMSを摂氏60度で12時間硬化させます。硬化したら、PDMSとマスターをプラスチック容器から取り出します。PDMSをシリコンウェーハから慎重に分離します。
次に、清潔なカミソリの刃を使用して、刻印された特徴の周りから余分なPDMSを取り除きます。次に、かみそりの刃を使用して、パターン化されたPDMSを個々の長方形のスタンプにカットします。これらのスタンプの特徴を上にして、直径100mmのきれいなシャーレに保管します。
次に、プレポリマーと硬化剤の同じ10:1の比率を使用して、脱気したPDMS溶液の新しいバッチを調製します。この溶液を直径100mmのシャーレに2〜3gスピンコートし、PDMSを60°Cで12時間硬化させます。次に、かみそりの刃を使用して、PDMSの薄層を長方形にカットし、スタンプのサポートとして使用します。
スタンプごとに2つのサポートが必要です。すべてのサポートが切断されたら、PDMSスタンプとサポートを70%エタノールに浸し、バイオセーフティキャビネットのアスピレーターを使用して乾燥させて滅菌します。バイオセーフティキャビネットで、各スタンプの上部に50マイクロリットルの1%BSA含有PBSを追加します。
液滴で覆われたスタンプを摂氏4度に最低4時間置き、BSAがスタンプの表面に吸収されるようにします。次に、スタンプをバイオセーフティキャビネットに戻し、PDMSスタンプからBSA溶液を吸引します。次に、スタンプの表面を50マイクロリットルの細胞培養培地で2回洗浄します。
各洗浄後にメディウムを吸引します。PDMSスタンプごとに直径35mmの組織培養ディッシュを1枚並べます。各皿に、PDMSスタンプの長さよりわずかに短い距離で隔てられた2つのPDMSサポートを置きます。
次に、ピンセットを使用して直径15mmのガラスカバースリップを拾い上げ、70%エタノールを使用して滅菌します。カバースリップから余分な液体をピンセットで保持しながら吸引し、別のシャーレに保管します。次に、4ミリグラム/ミリリットルのコラーゲン混合物の50マイクロリットルを各スタンプに直接分注して、PDMSスタンプの表面を均一にコーティングします。
ピンセットを使用して、コラーゲンコーティングされたPDMSスタンプをそれぞれ手に取り、ゆっくりと反転させます。組織培養皿のPDMSサポートの上に、逆さにしたスタンプのコラーゲン側を下にして下げます。次に、皿を摂氏37度で30分間インキュベートします。
次に、残りのコラーゲン混合物50マイクロリットルを各円形カバースリップに分注し、摂氏37度で30分間インキュベートします。この時点で、目的の細胞タイプを採取します。ここでは、EpH4マウス乳腺上皮細胞を1ミリリットルあたり1000万から1000万の濃度で懸濁しています。
次に、ゲル化したコラーゲンサンプルをインキュベーターから取り出します。ピンセットを使用して、PDMSスタンプをゆっくりとまっすぐ上に持ち上げて、成形されたコラーゲンからそれらを剥がし、廃棄します。コラーゲンジェルの特徴を歪めないように、スタンプをまっすぐ上に持ち上げることが重要です。
30マイクロリットルの濃縮細胞懸濁液を、所望の形状の成形空洞を含む各コラーゲンゲルの表面に分注します。明視野顕微鏡で細胞を観察しながら、皿を左右に静かに振ると、空洞内に細胞が定着するのを促進します。空洞は5分以内に充填されます。
空洞の周りから余分な細胞を取り除くには、各組織培養皿を横に傾け、コラーゲンゲルの表面に400マイクロリットルの細胞培養培地を静かに分注します。ゲル表面の余分な細胞が除去され、ゲルの空洞内の細胞が移動しないように、皿を傾けながら、ゲル上に培養培地をゆっくりと分注して穏やかに洗うことが重要です。液体を吸引し、さらに2回洗浄を繰り返します。
各洗浄の合間に顕微鏡でコラーゲンゲルをチェックし、余分な細胞が洗い流された様子を観察します。細胞が満たされた空洞の周囲から余分な細胞が除去された後、組織培養皿を摂氏37度のインキュベーターに15分間入れます。次に、ピンセットを使用して、コラーゲンコーティングされたガラスカバースリップを静かに反転させ、細胞充填コラーゲン型の上に置き、カバースリップからのコラーゲンが細胞充填空洞にキャップを形成するようにします。
サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。コラーゲンキャップが細胞充填コラーゲン型に付着したら、ゲルの上のガラスカバースリップの上に2〜2 1/2ミリリットルの細胞培養培地をゆっくりと分注し、サンプルを摂氏37度で1〜3日間培養します。これらの画像は、細胞播種前にI型コラーゲンゲルに成形されたアレイの低倍率および高倍率の画像です。
ウェルの形状は、シリコンマスター上のフィーチャの形状によって決まります。ここでは、長方形の井戸に乳房上皮細胞が充填されています。この例では、各200×50ミクロンの長方形のウェルには、約80〜100個の細胞が含まれています。
細胞播種から24時間後、ウェル内で細胞が互いに付着して組織を形成する様子が観察されました。培養液に成長因子HGFを添加してから24時間後、組織は分岐形態形成を受けていることが確認されました。細胞遊走に関与するタンパク質の1つは、この合成画像からわかるように、分岐が通常発生するウェルの端で増加する焦点接着キナーゼです。
このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば2時間以内に完了できます。この手順に続いて、牽引力顕微鏡法、リアルタイムRT-PCR、ウェスタンブロッティングなどの他の方法を実行して、細胞が移動するときに加えられる力や、関心のある遺伝子の転写産物およびタンパク質レベルの変化を決定することができます。このビデオを見れば、定義された初期形状の組織がコラーゲンゲル内に埋め込まれるこの3D細胞培養モデルの設定方法について十分に理解できるはずです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
本稿では、コラーゲンゲルに埋め込まれた三次元（3D）上皮組織の均一なアレイを構築する技術について解説します。この手法により、物理的および生化学的因子のハイスループットスクリーニングおよび精密な操作が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織工学
- 細胞挙動
- 生化学的分析
背景
- 組織形態形成を研究するには、3D組織の工学的構築が不可欠である。
- 機械的ストレスは、分岐形態形成に影響を及ぼす。
- 実験の精度を確保するためには、組織幾何学の再現性が極めて重要である。
- サンプルサイズを大きくすることで、得られた知見の統計的信頼性を高めることができる。
研究の目的
- さまざまな実験的コンテキストに向けて、同一の3D組織を構築すること。
- 機械的ストレスが細胞挙動に及ぼす影響を調査すること。
- 集団的な細胞挙動のメカニズムを理解すること。
使用した手法
- 組織工学のためのソフトリソグラフィーに基づく手法。
- 所望の配列をフォトパターニングしたシリコンマスターの作製。
- コラーゲンゲルへの組織の埋込。
- 組織サンプルのハイスループットスクリーニング。
主な結果
- 構築した組織の制御可能で再現性のある幾何学的形状。
- 物理的および生化学的因子を精密に操作できる能力。
- 実験的結論における高い統計的信頼性。
- 細胞集団の挙動メカニズムに関する洞察。
結論
- この手法は、組織工学のための堅牢なプラットフォームを提供します。
- 組織の発達に及ぼす機械的な影響の研究を促進します。
- 基礎的な生物学的プロセスの理解を深めます。
よくある質問
産業界における重要性
ECMに埋め込まれた均一な3D上皮組織を構築することで、組織の形状や微小環境因子を精密に制御することが可能となり、分枝形態形成や集団的な細胞挙動のメカニズム研究が促進されます。このアプローチは、前臨床での創薬における再現性と統計的検出力を向上させ、疾患に関連するシステムにおけるターゲットの検証や経路の解析を容易にします。また、牽引力顕微鏡法や分子アッセイなどのダウンストリーム解析との互換性があるため、リード化合物の同定や予測的なリスク低減ワークフローにおける有用性が高まります。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：組織の幾何学的構造を制御することで、上皮形態形成に対する力学的および生化学的影響を分離し、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：再現性のあるアレイ化された3D組織を提供し、遺伝学的または薬理学的な摂動の高スループット評価を支援する。
- 予測的価値：定義された微小環境と、分枝などの組織レベルで現れる表現型を関連付けることにより、メカニズムに基づくリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ECM（細胞外マトリックス）埋込環境における化合物スクリーニングの標準化基質として利用可能な、定量可能かつ幾何学的に定義された組織アレイを生成します。
- 運用的価値： 精密な組織間隔の配置と均一なコラーゲン埋込により、アッセイの標準化を可能にし、測定値のばらつきを低減します。
- 拡張性： 同一組織の並列処理をサポートし、用量反応試験やタイムコース研究のスループットを向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的妥当性：乳腺などの器官に関連する上皮組織の構造をモデル化し、がん浸潤やストロマ相互作用における疾患モデリングを支援します。
- メカニズムの連続性：発見段階の微小環境制御と、集団細胞挙動およびマトリックス再構成の前臨床評価を橋渡しします。
- リスク調整済み進展：組織の完全性と形態形成能に影響を与えるターゲットの早期段階での評価を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標的仮説の検証から前臨床検証に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、特に細胞とECMの相互作用の精密な時空間的制御を必要とする研究に有用です。
- 探索生物学：組織の形状およびECM組成を制御して変化させることが可能であり、機械的刺激受容（メカノトランスダクション）経路の解析による仮説検証を支援します。
- スクリーニング：コラーゲンに埋め込まれた、アッセイに使用可能で再現性のある3D組織を提供し、組織レベルの表現型に対する化合物の影響を評価するのに適しています。
- 分析：構造的および空間的なリードアウト（例：分枝パターン、細胞の配向）を生成し、これらを定量化して分子エンドポイントと相関させることができます。
- トランスレーショナルリサーチ：構築された上皮構造を、浸潤やストローマの再構築など、疾患に関連する組織プロセスに結びつけます。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトや細胞型にわたって標準化された3D組織を生成するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：組織構造のばらつきを抑え、精密な環境制御を可能にすることで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用上の価値：成形された組織アレイと定義されたECM埋め込みにより、標準化と再現性を促進する。
- 戦略的価値：メカニズム経路に結びついた定量的かつ形態ベースの読み取り値を提供することで、go/no-go判断の質を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：組織の形態形成および集団的挙動への影響に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを支援する。
実施上の注意点
- ソフトリソグラフィー、組織培養、およびECM（細胞外マトリックス）の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- マスター作製のためのフォトリソグラフィー装置およびPDMSモールド作製能力へのアクセスに依存します。
- チーム間でのコラーゲン濃度、ゲル化タイミング、および細胞播種プロトコルの標準化が必要です。
- 代替ECMタンパク質（例：Matrigel、フィブリン）への適応には、ゲル化および組織安定性の最適化が必要な場合があります。
- 実用上の制限として、スタンプの除去およびゲルの操作中に組織の歪みを避けるための慎重な取り扱いが必要です。
