クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

本手順の全体的な目的は、生体顕微鏡を用いてマウス脳内の微小循環を研究することです。これにより、血流動態および炎症マーカーの動的な変化を、皮質微小循環において長期間にわたって追跡することが可能になります。この手法はLa Jolla Bioengineering Instituteで開発され、多くの種類の研究に使用されてきました。例えば、plasmodium burgi onca感染の経過中、および脳マラリア発現時の血流動態の変化の追跡などが挙げられます。

これは、まず生体内顕微鏡観察の2週間前に慢性的頭蓋窓を設置することで達成されます。手順の第2ステップでは、低倍率の高解像度デジタル画像を用いて、頭蓋窓の全体的な形態を記録します。手順の第3ステップでは、通常光および蛍光照明を用いて生体内顕微鏡画像を撮影し、血管径とRBC速度をオンラインで測定するための特定の観察部位を選択します。

本手順の最終ステップでは、蛍光標識した特異的抗体を用いて、小血管における白血球および血小板の接着について生体内解析を行います。最終的に、脳生体内顕微鏡観察を通じて、生理学的、病理生理学的、または疾患状態のモデルにおける脳内の微小循環変化をin vivoで得ることができ、これらの状態に関連する血行動態の変化を明らかにできます。この手法の主な利点は、外部薬剤や人工培剤にさらすことなく、生理学的環境下で脳を観察できることです。生体内顕微鏡観察は、磁気共鳴画像法（MRI）や血管造影法と比較して空間分解能と時間分解能に優れており、微視的なレベルでの観察を可能にします。

本手法は、急性および慢性疾患における血行動態および炎症性変化など、脳微小循環の生理学および病態生理学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。生体顕微鏡観察の2〜3週間前に、8〜10週齢のマウスに対して開頭術を行います。手順は既報の通りですが、動物の頭部にチタンバーは配置しません。慢性頭蓋窓は安定した調製法であり、埋込から数ヶ月後であっても、実験当日に脳微小循環の観察が可能です。

まず、動物を定位固定装置に設置する前に、その体温を確認します。あらかじめ調製した蛍光標識赤血球をマウスの尾静脈から注入します。これにより、後ほど説明する赤血球のトラッキングが可能になります。その後、イソフルランを用いてマウスに軽度の麻酔をかけます。

導入には4%、維持には1～2%を使用します。次に、動物を加熱パッド上の定位固定装置に腹臥位で配置します。イヤーバーを使用して頭部を慎重に固定し、左右のレバーを使用して水平度を調整します。

ミネラルオイルで湿らせた綿棒を用いて、頭蓋窓のカバーガラスを優しく清掃します。次に、デジタルカメラに接続した実体顕微鏡を使用し、窓の下にある血管のパノラマ写真を数枚撮影します。パノラマ写真をコンピュータに転送した後、印刷・識別・日付記入を行うための最適な写真を選択します。

この写真は、血管径と赤血球速度の測定用マップとして使用されます。これらは、この後に行う生体顕微鏡観察の開始手順の中で示します。マウスを専用の生体顕微鏡ステージに移動させます。歯科用アクリルで形成されたウェルの形状を利用して、頭蓋窓の上に水滴を落とします。

開口数 0.5 の 20倍水浸対物レンズを使用します。画像は2台のカメラを用いて記録します。1台はコンピュータとモニターに接続されたデジタル低照度高速カメラであり、もう1台はVCRテープ、タイムスタンプ、およびカラーモニターに接続された低照度アナログカメラです。測定する血管を選択する前に、血管を確認して標本の作製品質を評価し、すべての血管で血流が認められる場合にのみ、測定対象となる血管を選択します。選択する血管には、異なる口径の静脈と動脈を含め、ウィンドウによって露出した領域内の異なる部位をカバーするようにしてください。

本実験では、頭蓋窓内のさまざまな視野を確認しながら、測定用に12本の血管を選択します。血管を選択するために、あらかじめ撮影したPY血管系の写真において、測定を行う各箇所の正確な位置をアノテーションします。各箇所について、イメージシェアデバイスを用いて血管径を測定します。測定箇所を選択したら、血管の画像を垂直方向に合わせ、反対側までイメージシェアリングを行います。

両端を合わせ、読み取り値を記録します。赤血球のトラッキングでは、各スポットをデジタルカメラで少なくとも30秒間記録し、ビデオ画像は150 frames per secondで記録します。この速度は、最大6 millimeters per secondまでの速度を決定するために、1ビデオフレームあたり1〜6枚の細胞画像を取得するように設定されています。

データ収集が完了したら、マウスを脳定位固定装置から取り外し、適切なソフトウェアを用いて麻酔から回復させるため、ケージに戻します。取得したビデオ画像はデジタル化され、各細胞画像のXY座標データが得られます。細胞の位置は、画像解析ではなく手動で決定します。

熟練した観察者の目による判断は、細胞中心の位置を良好に推定でき、これは一般的に観察される最大蛍光強度となる位置と一致します。ほとんどの細胞の向きにおいて、各血管につき15個の細胞について位置と速度の決定を行います。血管径とRBC速度の測定値が得られた後、平均値を算出して平均RBC速度を求めます。

各血管における血流量の算出は、灌流の評価および細血管における白血球接着の解析のため、公式 Q = (D/2)² × π × V（ここで Q は血流量、V は RBC 速度、D は血管径）を用いて行うことができます。生体内顕微鏡観察は、FSE 標識 albumin と Texas Red で標識した汎白血球マーカー CD 45 に対する抗体の混合物を注入した動物に対して実施します。蛍光標識された albumin により、貫通血管を含む血管ネットワークの可視化が向上し、特に脳マラリアなどの疾患状態で、非灌流または低灌流血管を確認する際に有用です。

蛍光標識抗CD 45抗体を用いることで、白血球のローリングおよび血管壁への接着を容易に識別し定量することができます。白血球接着の定量化は、100 µmの血管長における白血球数をカウントすることで行います。ローリングの定量化は、同一の100 µmの長さにおいて、30秒間に血流速度よりも有意に遅い速度で移動する白血球数をカウントすることで行います。図に示す通りです。

高速蛍光撮影による細胞トラッキングを用いた微小血管内赤血球速度測定の例を以下に示します。ビデオ録画の画像AからFは、微小循環の連続画像です。各画像は、高速カメラによってフレームごとに捉えられた、流動する単一の赤血球の位置を表しています。

代表的な実験から得られたこのグラフは、時間の経過に伴う髄膜血流の変化を示しています。plasmodium, burgi, oncaに感染したマウスでは、非感染のコントロールマウスでは髄膜血流が時間とともに比較的安定しているのに対し、PBA感染マウスでは脳マラリアの発症時に血流の著しい減少が見られます。

6日目に、抗CD 45 Texas red蛍光抗体で染色すると、plasmodium burgi oncaに感染したマウスの肺血管に多数の白血球が付着していることがわかります。この手順は、本日の目的以外にも幅広い応用が可能です。in vivoで使用可能なあらゆる光学技術をこのモデルに適応させることができ、組織、組織内の酸素レベル、pH、活性酸素種、および内皮細胞と白血球の相互作用などのパラメータをこのモデルで研究することが可能です。