頭蓋窓を介して新皮質の血流の2光子イメージングのための方法

生存しているげっ歯類の脳において、脳血管をイメージングし血流動態を記録できる能力は、脳虚血や正常な脳生理学の研究に適用可能な強力な手法です。ここでは、尾静脈に注入した蛍光染料を用いて、生存マウスの新皮質における血流動態をイメージングするための二光子顕微鏡の使用方法を実演します。この手法は、もともとDavid KleinfeldとWinfred Dankによって開発されました。

こんにちは。カリフォルニア大学ロサンゼルス校、神経学部のCarlos Porter Cayo研究室のRicardo Motaです。前回のビデオでは、in vivoでの慢性的なイメージング実験に向けた頭蓋窓の埋め込み方法をご紹介しました。本日は、頭蓋窓を通じて大脳皮質における血流動態をイメージングする手順について解説します。

この作製法は、2光子レーザー顕微鏡を用いて脳の深部をイメージングできるため、非常に有用です。それでは、手順を開始しましょう。脳血管系をイメージングするために、動物に蛍光色素を静脈注射する必要があります。

デキストラン結合色素を使用するのは、デキストラン基が色素の血液脳関門の通過および血管外への漏出を防ぐためです。マウスをイソフルランで麻酔し、導入には4%、注入中は1.5〜2%を用います。次に、尾を70%アルコールで3回拭いて消毒し、26ゲージの針を用いて、生理食塩水に溶解した5% Rhodamine Dextran溶液75〜100 µLを尾静脈に注入します。

尾のシャフトの中ほどで、尾静脈注射の直後から、色素が尿中に排泄されるまで動物のイメージングが可能です。ERODomine色素を使用した場合、尿はピンク色になります。蛍光Dexter色素の注射から約2時間後、マウスをイソフルランで麻酔します。導入には4％、イメージングには1〜1.5％を用います。マウスはチタンバーを使用して顕微鏡ステージにしっかりと固定します。ステージには、動物の体温を維持するための温度調節機能付き加熱パッドが備わっています。

眼を湿潤に保つため、眼軟膏を塗布します。頭蓋窓のカバーガラスを70%アルコールで洗浄します。窓を焦点面と平行に配置し、視野の中心に合わせます。

4倍対物レンズを用いて、デジタルカメラで脳表面血管の写真を撮影するのが最適です。この写真は、日々のイメージングセッションにおいて、同一の画像領域を繰り返し特定するための参照画像として使用されます。その後、4倍対物レンズを水浸40倍対物レンズに交換します。

ステージを動かさずに、視野のデジタル画像を撮影します。その後、ステージマニピュレーターの座標を再びゼロに設定します。画像取得ソフトウェアにはscan imageを使用します。

これは、Carls Votoの研究室にて、Tom Paul RudoとBernardo SabatiniによってMATLABで作成されました。次に、レーザー、パワーメーター、光電子増倍管、アンプなどのその他のすべての装置を起動します。イメージングに適したウィンドウ領域を低倍率で簡潔にスキャンし、最適な領域を特定します。

これらを特定した後、撮影対象領域の低倍率スタック画像を取得し、小血管または毛細血管における血流ダイナミクスを記録するためにそのXY座標を注記します。目的の血管に沿って、少なくとも40 µmのラインスキャンを行います。1秒間に1回行うこれらのシングルスイープは、可能な限り低いレーザー出力で実施し、スキャンの座標と角度を記録します。

イメージングセッションが終了後、動物を温熱チャンバーに移し、麻酔から回復させます。ここでは、尾静脈からr-dextranを注入した5ヶ月齢のマウスの体性感覚野上に設置した頭蓋窓を通じて、2光子顕微鏡を用いて5 µm間隔で撮影した100枚の画像スタックを示します。この一連の画像には、毛細血管を含む大小さまざまな血管の複雑なネットワークが示されています。

私たちは、頭蓋窓を通じて生体内の血流ダイナミクスを可視化する方法を実演しました。これは、皮質血管における脳血流ダイナミクスをイメージングするための非常に強力な手法であり、例えば脳卒中後の血流の変化を調査する場合などに有用です。蛍光色素を尾静脈に繰り返し注入することで、個体ごとに異なる時間経過で複数回のイメージングを行うことが可能です。

この手順を行う際は、可能な限り清潔で無菌の状態を保ち、非常に慎重に操作することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。