トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

本実験の全般的な目的は、InVivoモデルシステムを用いてベータアミロイドペプチドの毒性を評価することです。このアッセイは再現性が高く、比較的簡便であるため、薬剤や環境条件、あるいは遺伝子改変がベータアミロイドの毒性に及ぼす影響を迅速に検証することが可能です。このアッセイを開発する上での鍵となる要因は、筋肉特異的な温度誘導性ベータアミロイドペプチド発現を持つC. elegansのトランスジェニック虫を作出することです。

この温度感受性発現は、異常に長い3'非翻訳領域を含む外来遺伝子を構築することで設計されており、これにより外来遺伝子のmRNAがmRNA監視機構の標的となります。したがって、機能的なmRNA監視機構を持つ野生型虫では、外来遺伝子mRNAの分解が起こるため、この外来遺伝子の発現は低くなります。この外来遺伝子を、mRNA監視機構の必須構成要素に突然変異を持つ遺伝的背景に導入すると、外来遺伝子の発現は著しく高まります。また、遺伝的背景にmRNA監視機構の温度感受性変異がある場合、非許容温度でこのトランスジェニック系統を増殖させると、外来遺伝子mRNAの分解が阻止され、高い外来遺伝子発現がもたらされます。このシステムを用いて体壁筋におけるベータアミロイドペプチドの発現を制御するトランスジェニック虫では、温度を16 °Cから25 °Cに上昇させることで、ベータアミロイドペプチドの高度な蓄積、筋細胞の機能不全、および虫の麻痺が引き起こされます。時間の測定。

これらのトレンチジェニック虫の集団が、温度上昇後に麻痺するまでの時間を測定します。温度上昇は、アミロイドベータ毒性を評価するための感度の高いアッセイです。麻痺率に影響を与える可能性のある環境変数を最小限に抑えるため、麻痺アッセイ用に新鮮な線虫増殖培地プレートを作成してこれを実施します。

第2段階として、トランスジェニック線虫の年齢を同期させ、発生段階がトランスジーンの発現に及ぼす影響を最小限に抑えます。次に、同期させた第3幼虫期の個体を16 °Cから25 °Cに温度上昇（アップシフト）させ、トランスジーンmRNAの安定性を高めることで、βアミロイドペプチドを蓄積させます。各線虫について、温度上昇から麻痺に至るまでの時間を測定することで、筋肉機能不全の速度を把握し、これによりβアミロイドペプチド蓄積の毒性作用を評価します。得られた結果から、特定の処理が内生的に発現したβアミロイドペプチドの毒性に及ぼす影響を明らかにします。

したがって、薬物活性を評価するためにトランスジェニックマウスモデルを使用する場合と比較して、本手法の主な利点は、はるかに迅速かつ低コストで実施できる点にあります。この手法を視覚的に提示することは非常に重要です。麻痺アッセイにおけるL4期のワームのスコアリングを習得するのは非常に困難であるためです。

麻痺したL4期の個体をスコアリングする際は、虫の頭部領域のみが独立して動いているかを確認します。頭部は動いているが、虫の体全体が麻痺している場合に、その個体を「麻痺」としてスコアリングします。麻痺アッセイは、C. elegansの維持および遺伝学研究に日常的に使用されている標準的な線虫増殖培地（NGM）プレートを用いて行います。

プレートを準備するために、塩化ナトリウム、アガロース、およびペプチドを含むNGM溶液をエルレンマイヤーフラスコに入れ、オートクレーブで滅菌します。その後、付属の書面プロトコルに記載されている適切な量の各滅菌溶液を添加します。液体状のNGMを、60 mm × 15 mmのペトリ皿1枚あたり10 mLずつ分注します。NGMを室温で一晩静置し、凝固させます。

化合物や抽出物の効果を試験する場合は、抽出物を各プレートに分注し、スプレッダーを用いてプレート表面に均一に塗布します。プレートを室温で一晩乾燥させてください。1 mLを超える容量の場合は、乾燥にさらに時間を要します。

次に、LB培地でOD 0.4から0.6まで一晩培養したe coli strain OP 50を、各プレートに250 µLずつスポットし、室温で一晩置いて細菌を乾燥させます。プレートの作成からの経過日数は麻痺率に大きな影響を与え、古いプレートほど乾燥する傾向があります。プレートは麻痺アッセイの1週間以内に作製してください。

理想的には、同期卵産卵の3〜4日前に作製したプレートを使用してください。実験に使用するプレートはすべて同じバッチである必要があります。ローン（菌叢）のサイズや細菌を変更すると、ワームの行動も変化します。麻痺アッセイは、代替の e coli 株を用いて実施することも可能です。例えば、RNAi実験ではHT115が使用されます。ただし、これにより麻痺アッセイのキネティクスが変化する可能性があります。

したがって、適切な系統の内部コントロールを使用する必要があります。β誘導性麻痺のアッセイには、一般的にCL 476系統が用いられます。この系統およびその他のトランスジェニックモデルは、Saint Ahadi Genetic Centerから少額の手数料で学術研究者が利用可能です。

試験集団の齢同期性を最大限に高めるためには、同期させた親世代から開始することが望ましい。試験集団の麻痺アッセイを開始する1週間前に、プラチナワームピッカーを用いて、20〜30匹の成熟成虫を数枚の10 centimeter NGMプレートに転移させる。

CL 4 1 76の許容温度である16°Cにて、OP 50と共に2時間播種し、産卵させます。GR成虫を除去し、子孫を7日間育成させます。この時点で、それらは2日目のgravid adult（抱卵成虫）となります。2日目のgravid stateです。

各実験条件における年齢同期化した試験集団を調製するために、成虫を使用します。目的は、白金線ワームピッカーを用いて、50から75匹の年齢同期化したワームを含むプレートを3枚作成することです。day 2の成虫10から12匹を、OP 50をスポットした60 mm NGMプレートに移します。16 °Cで2時間、ワームに産卵させ、その後成虫を除去し、16 °Cで卵を孵化・成長させます。

この時点で、プレートのスコア付けを行わない人物にコーディングを行ってもらい、実験条件が分からない状態でスコア付けができるようにするのが最善です。産卵時の胚発生段階（最適条件下での野生型虫の場合、およそ26細胞期）は、成虫の齢および栄養状態に依存します。産卵に使用する成虫が高齢であるか、あるいは飢餓状態にある場合、より発生段階が進んだ卵が産み付けられるため、同期集団が得られず、結果として麻痺アッセイの速度論に影響を及ぼします。

いかなる種類の細菌汚染も本アッセイに深刻な影響を及ぼす可能性があるため、E. coli OP50などの単一菌株の細菌培養物を使用することが不可欠です。3連のプレート間で線虫の数が同程度である場合に、再現性が最も高くなります。トランスジェーンを誘導し、麻痺アッセイを実施するために、プレートを25 °Cに昇温させます。

同期産卵の終了から48時間後、線虫は第3 larval stage（L3期）に達しているはずです。プレートを25 °Cのインキュベーター内で積み重ねずに配置し、プレートをこの温度に到達させます。同時に、温度上昇（upshift）の開始から18〜20時間後に、線虫の麻痺のスコアリングを開始してください。

この時点で、個体群内のすべての虫が第4 larval stageに達しているはずです。各プレート上のすべての虫が麻痺するまで、2時間おきにスコアリングを続けてください。理由は不明ですが、麻痺は体の全長にわたって均一に起こるわけではありません。頭部領域が、虫の体の中で最後に動きが止まる部位となります。

したがって、麻痺が始まったばかりの虫はプレート上を移動することはできませんが、頭部を動かすことは可能であり、それによって前方の細菌を除去し、細菌が消失したハロー（浄化帯）を形成します。これらの虫は必然的に完全に麻痺するため、ハローを持つ虫は麻痺していると定義されます。一部の虫はハローを持ちませんが、同時に自発的な運動も見られません。

これらはワームピッカーでつつくことでテストします。つついた際、全身に波状の伝播が起こらないワームは、効率的にスコアリングを行うため、同様に麻痺していると判定します。麻痺したワームは、次のスコアリング期間に誤って再度カウントされないよう、プレート上の印のないセクターに移動させるのが最も簡単です。

これにより、誤って分類されたワームが運動を示すことができ、スコアリングの修正を行うことで麻痺曲線を生成することが可能になります。各時点で、各プレート上の麻痺していないワームの割合をパーセンテージに変換し、平均非麻痺率を、アップシフト開始時からの時間に対してプロットします。得られた曲線は形式的に生存曲線と同様であるため、標準的な非パラメトリック生存統計を用いて分析することができます。

麻痺を誘発させるには、トランスジェニックmyo-3 Aβ虫のアップシフトをL4期の中盤までに完了させる必要があります。Myo-3プロモーターは発生的に調節されており、虫がL4期後半または成虫に達すると、発現レベルが著しく低下します。

線虫を飢餓状態にすると導入遺伝子の発現が阻害されるため、実験期間中、線虫に十分な餌を与えることが非常に重要です。麻痺した線虫が回復した例は、どのような条件下でも観察されていません。Upshift後12〜16時間で、CL 41 76は麻痺します。たとえ16 ℃にdownshiftしても、CL 41 76株では麻痺を引き起こす導入遺伝子の発現上昇がより低い温度で起こる可能性があるためです。

ただし、麻痺率が生じるタイミングは影響を受けることにご注意ください。麻痺率は、使用する特定の導入遺伝子系統によって異なります。当研究室では、CL 41 76よりも麻痺率が速い系統および遅い系統のmyo-3 Aβ系統を構築しており、そのため、麻痺アッセイのスコアリングウィンドウを適宜調整する必要があります。

ここでは、未処理および 6.27 millimolar のカフェインに曝露させた CL 4 1 76 の麻痺曲線のプロットを示します。この処理により、約 4 時間という統計的に極めて有意な麻痺の遅延が生じており、これはベータ毒性の抑制を示唆していると解釈されます。このモデルにおける本実験では、コーヒーに含まれる別の化合物の影響を評価しました。

このプロットは、ベータ毒性に影響を与えない処置における典型的な結果です。どちらの実験においても、未処理のCL 4 1 76個体群の約半分が24時間で麻痺し、28時間までに完全に麻痺していることに注意してください。これらは対照群の麻痺における典型的なタイムフレームです。

CL 4 1 7 6集団において、このタイミングから大幅に逸脱した場合は、環境条件の変化または導入遺伝子コピーの自発的欠失が示唆されます。菌株CL 4 1 76に関する詳細については、付属のプロトコルを参照してください。本手順を実施する際は、プレートの経過日数、虫集団の齢期、および虫の麻痺率をスコアする能力に留意することが重要です。

このビデオを視聴することで、この海鞘（かいちゅう）システムを用いてベータアミロイドの毒性を慎重に測定する方法を十分に理解できたはずです。これにより、さまざまな環境要因や薬剤処理がこの毒性に及ぼす非常に微細な影響を検出できるようになります。ここまで説明した変数は、アッセイの再現性を高め、麻痺のキネティクスを一貫させるために非常に重要であるため、十分注意して管理してください。

これは、異なる時期に異なる担当者が同じ研究室で行った結果を比較する場合や、このモデルシステムを用いた他の研究者の結果と自身の結果を比較する場合において、非常に重要です。