潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Caldwellラボ（別名：Worm Shack）では、C. elegansにおける神経疾患のメカニズムを研究しています。そして、実りある実験に明け暮れた一日の終わりには、レクリエーション活動で自分たちにご褒美を与えます。こんにちは。私はアラバマ大学生物科学科のCaldwell研究室に所属する学部生のAdam Knightです。

本日は、C. elegansを用いたドパミン神経変性アッセイの実施方法を解説します。ドパミン神経変性虫株と、疾患関連候補遺伝子およびドパミン神経を過剰発現するトランスジェニック株を交配させます。こんにちは、Caldwell研究室の大学院生、Adam Harringtonです。

今日は、ドーパミン作動性ニューロン解析のためのトランスジェニック線虫の準備方法について説明します。大学院生のShu Amichiです。ここでは、C. elegansのCEPおよびADEと呼ばれるドーパミン作動性ニューロンをアッセイする方法を紹介します。

一般的に、ドーパミン作動性ニューロンにおいてGFPのみを発現している線虫では、細胞死は見られません。しかし、CLEが存在すると、細胞死および加齢に伴う神経変性が観察されます。このアッセイを用いることで、ドーパミン作動性ニューロンに別のトランスジェンを共発現させ、それがCLE誘発性の毒性を増強するか、あるいは抑制するかを判定することが可能です。それでは、始めていきましょう。

ドーパミン作動性ニューロンの解析を行う前に、まず適切なGaN系統を交配させる必要があります。ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーターdat-1の制御下でalphas nucleおよびGFPの両方を発現する8匹の虫を交配プレートに移します。次に、目的の候補遺伝子のドーパミン作動性ニューロン特異的発現と、選択マーカーであるDS red twoの体壁筋細胞での発現を示す、L4期のトランスジェニックなca雌2匹を加えます。各トランスジーン構築物について、3つの安定したトランスジェニック系統を作成している点に注意してください。

したがって、この遺伝交雑は、作成された3つの独立した安定系統それぞれに対して個別に実施する必要があります。2日後、さらに2～3日経過したところで雄を取り除いて廃棄します。その後、F1世代を確認してください。

オスの子孫が数匹得られ、交配は成功しました。次に、オス親から受け継いだGFP蛍光マーカーと、hamadi親から受け継いだDS red two蛍光体壁筋マーカーの両方を示す個体を、各交配からAphrodite L4の新しいプレートに5匹ずつ個別に移します。移した個体は、まだ成熟（M）していないことを確実にするため、L4段階である必要があります。

オスをプレート上に配置した状態で、F2世代の子孫を得るために3〜4日間自然交配させます。次に、F2世代の子孫を回収します。具体的には、両方のセントマーカーを示す個体を5〜10匹選び、それぞれ個別のプレートに転移させます。

次に、F3世代をスクリーニングし、すべての個体のドーパミン作動性ニューロンでGFPが発現しており、かつ一部の個体で体壁筋細胞にDsRed2蛍光マーカーが発現しているプレートを選出します。これらの個体は、α-synuclein遺伝子とGFP遺伝子のホモ接合体であり、新しく作成したトランスジェニック遺伝子を安定して伝達しています。スクリーニングが完了したら、ドーパミン作動性ニューロンの解析を行う準備が整います。

ニューロン解析を開始するために、前段階で特定した3匹の個体を用いて新しいプレートを調製します。3つのトランスジェニック系統それぞれについてプレートを用意してください。さらに、コントロールとしてalpha-synuclein GFP単独株のプレートも用意し、線虫を成体まで成長させます。

虫が成体になったら、各系統から30〜40匹の形質転換個体を新しいプレートに転移させます。20 °Cで5時間卵を産ませます。5時間後、個体を回収して廃棄します。

成体を20 °Cで3〜4日間維持し、胚がL4ステージに達するまで発育させます。次に、0.04 mg/mLの5-fluoro-2'-deoxyuridineを含むプレートに、トランスジェニックのL4個体を約100匹ピックアップして移します。

このヌクレオチドアナログは、DNA合成を阻害することで次世代の発生を抑制します。FDURプレートは光感受性があるため、プレートにカバーをかけ、全体を包んで遮光してください。線虫解析用のアガロースパッドを作成します。

これらは新鮮な状態で使用し、乾燥させないようにします。テープを縦に貼った顕微鏡スライドガラスを2枚用意してください。このテープは、パッドの厚さを均一にするためのスペーサーとして機能します。

それらの間に3枚目のスライドをベンチ上に置きます。これで、3枚が横に並んで配置されました。

溶融したアガロースをスライドの中央に1滴滴下し、別のスライドをそれに垂直かつ3枚すべてのスライドにわたるように素早く上に重ねます。分析するサンプル数に合わせて、必要な数だけ同様にアガロースパッドを作成します。アガロースパッドの準備ができたら、22 × 30 mmのカバーガラス上に、3 mMの11-MEAおよび麻酔薬を6 µL滴下します。

成体40匹を液滴に集め、カバーガラスを反転させてagrosパッド上に載せます。他の各系統についても同様に繰り返します。各系統につき30匹の個体を観察し、それぞれのCEPおよびDニューロンの有無をスコア付けします。

FITCまたはGFPの可視化が可能なフィルターキューブを備えたエピ蛍光共焦点顕微鏡を用い、endo G-F-P-H-Y-Qフィルターキューブを使用してデータをスコアリングシートに記録します。野生型個体では、4つのCEPニューロンおよび2つのA DEニューロンすべてでGFPが完全に保持されています。Dニューロンの消失を示す個体は、既知の野生型または変性個体としてスコア付けされます。

これらのニューロンは、LG（GFPの消失）として記録されます。同様に、動物ごとの総消失ニューロン数をカウントすることで、変性の程度をスコアリングできます。また、各系統につき1回あたりさらに30匹の動物を用いて、この解析をさらに2回繰り返します。

3回の解析で野生型のドパミン作動性ニューロンを示した個体数の合計を平均します。次に、Studentのt検定を用い、P値0.05未満を基準として神経保護能の統計解析を行います。コントロール群の個体と、ドパミン作動性ニューロンで候補遺伝子を過剰発現させる系統を比較するため、産卵後のさまざまな日にかけてこの解析を実施し、適切な解析日を経験的に決定します。

例えば、alpha CLEとGFPを共発現させた個体において、発生後6日目、7日目、および10日目に、それぞれ77%、87%、90%の個体でドーパミン神経細胞の変性が認められることが判明しています。したがって、目的の導入遺伝子が神経変性を促進すると予測される場合は6日目に解析を行います。同様に、神経変性を抑制すると考えられる導入遺伝子については、7日目および10日目に解析を行います。

以上で、C. elegansを用いたドーパミン神経変性アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、1つ目に、遺伝学的交雑の際の選別には適切なマーカーを使用すること、2つ目に、交雑には健康な雄およびL4期のハーミフロダイトを使用することを忘れないでください。

次に、CEPニューロンとDEニューロンを注意深く、かつ一貫してスコアリングしてください。この手順により、$\alpha$-CLET誘発性神経変性を増強または抑制する可能性のある遺伝因子の迅速なアッセイが可能になります。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。