開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）

本実験の全体的な目的は、個々の代謝経路、遺伝的改変、または薬理学的処置によって引き起こされる、解糖系、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸回路における全動物レベルでのリアルタイムな代謝変動を非侵襲的にモニタリングすることです。これは、生存している線虫に安定同位体を投与し、より多くの代謝物に十分な同位体濃縮を行うことで、中間代謝経路における遺伝的または薬理学的改変の定量化を可能にすることによって達成されます。第二のステップとして、大気中および溶解した二酸化炭素への同位体取り込みをガス比質量分析法で測定し、これにより短期間における中間代謝フラックスのより直接的な評価を行います。

次に、線虫における代謝フラックスの変化を定量化するため、HPLCを用いた全虫遊離アミノ酸分析、およびGCMSを用いたアミノ酸および有機酸の同位体濃縮分析を行い、試料を処理します。安定同位体への曝露後、野生型虫において、同位体曝露時間の変動、細菌の除去、および代替的な虫の破砕が中間代謝物の同位体存在量に及ぼす影響を示す結果が得られます。この手法により、中間代謝に関する知見を得ることが可能です。

本手法は、哺乳類細胞株や組織などの我々の系にも適用可能です。もともとこの手法を考案したのは、HPLCによる遊離線虫アミノ酸分析において、一次呼吸機能の変化に伴う中間代謝フラックスの障害を示唆する一貫した異常を観察したときでした。それでは、本手順を開始します。

発生期または成体期に安定同位体標識された代謝前駆体に曝露させた線虫を、1.5 mLのプラスチック製遠心チューブに回収します。通常、線虫の濃度が1 mLあたり1000匹になるように希釈します。内部標準としてε-アミノカプロン酸を含む60%過塩素酸を線虫に加え、最終濃度が4%過塩素酸および20 nMの内部標準となるように調製します。

重力で線虫を5分間静置させた後、上清を取り除き、別のチューブに保存します。次のステップはこの手順において最も重要な工程の一つです。遊離代謝物の分析を行う前に、スクリーニングによって線虫を完全に破砕する必要があります。プラスチック製ホモジナイザーと電動ドリルの使用により、線虫サンプルを15秒間粉砕します。

光学顕微鏡で虫体が破砕されたことを視覚的に確認し、必要に応じて研磨を繰り返します。この画像において、パネルAとBは研磨前の虫体を示しています。研磨後の虫体を示すパネルCおよびDとは対照的に、あらかじめ保存しておいた上清を1.5 milliliterのプラスチック製遠心チューブに移し、虫体ホモジネートを遠心分離します。

サンプルを2,250 RPM、1,300 Gsで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい7 mLのガラスチューブに移します。ペレットは、後のタンパク質濃度測定で使用するため保存しておきます。

次に、サンプルのpH範囲が7～8になるまで、上清に通常濃度の水酸化カリウムを4回分加えます。塩を除去するため、7 mLガラスチューブに入れた中和済みサンプルを2,250 RPM（1,300 G）で5分間遠心分離します。各サンプルの上清を新しい7 mLガラスチューブに移します。これで、中和済みサンプルを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）による代謝物定量に用いる準備が整いました。HPLCについては以下の通りです。

中和した各サンプルから 50 µL を分注し、HPLC に直接注入します。遊離アミノ酸の定量は、アルデヒドを用いた事前誘導体化と蛍光検出を用いて行います。既報の通り、残りの中和サンプルは、次節に示すように、アミノ酸および有機酸の同位体濃縮度を決定するための GCMS 分析に向けて、イオン交換樹脂を用いた抽出に供します。

ビーズを調製するために、1N 塩酸をG1およびG50ビーズにそれぞれ加えます。1Lビーカー内で、マグネチックスターラーを用いて各フラスコを30分間撹拌します。その後、洗浄液のpHが水のpHと等しくなるまで、脱イオン水でビーズを10回洗浄します。

次に、ガラスピペットを用いた低コストのカスタムメイドカラムの作製方法を説明します。既製のカラムは市販もされています。カラムを作製するには、ピンセットを使用してパストゥールピペットチップの最も狭い部分の直上にコットンプラグを挿入し、有機酸抽出用のG 1ビーズおよびG 50ビーズを使用します。

アミノ酸抽出には、各カラムの高さを約3分の1まで満たします。試料がすでに中性pHである場合は、AG 1カラムに適用する前に試料に何も添加しません。アミノ酸抽出のために有機酸を抽出する場合は、AG 50カラムに適用する前に、試料に0.1 normal 塩酸を1 mL添加します。

あらかじめ調製した中和済みサンプルを各カラムに適用します。洗浄液が中性になるまで、各カラムを水で10回洗浄します。洗浄完了後、各カラムを、ラベルを貼った新しい4 mLガラスサンプルバイアルに溶出させます。有機酸の抽出を行う場合は、AG 1カラムに3 N塩酸を3 mL加えます。

これにより、3炭素種、4炭素種、5炭素種、および6炭素種の各炭素種におけるラベル化炭素の総数の同位体濃縮度の分析が可能になります。アミノ酸抽出には、4 Nの水酸化アンモニウム3 mLをG 50カラムに加えます。これにより、3炭素種および5炭素種のラベル化炭素の総数における同位体濃縮度の分析が可能になります。

有機酸およびアミノ酸の抽出が両方完了した後、サンプルバイアルを反応性アプリ3蒸発器に入れ、乾燥するまで一晩放置します。その後、サンプルを誘導体化し、プロトコルの本文に詳述されている通りにGCMSで分析します。まず、ユニバーサルラベル化された13CグルコースとE. coliを含む実験用35 mm NGMアガープレートに、1,000匹の若成虫の線虫を移すことからこの手順を開始してください。

次に、カバーを外した実験用NGMプレートを配置します。これは、正確な大気のサンプリングと置換を可能にするために、密閉された3方コックを備えたカスタムガラスチャンバー内で行います。光学的に透明なガラスディスクがプレートに接するシール部分を、高真空グリースで覆います。

ガラスディスクでチャンバーを密閉します。時間を記録してください。0分として、30分後に20 milliliterシリンジを用い、三方活栓からガラスチャンバー内の雰囲気ガスを10 millilitersサンプリングします。

チャンバーへのストップコックを閉じます。サンプリング後、サンプルを0.1 M水酸化ナトリウム溶液中の一ミリリットルの重曹を含む真空レッドトップガラスチューブに移します。次に、三方コックを介してガラスチャンバーに10 mLの空気を注入します。20 mLシリンジを使用して、チャンバーへのストップコックを閉じます。大気を再注入した後、インキュベーションを再開する前に、60分、90分、120分でガラスチャンバーから大気のサンプリングを繰り返します。

プロトコルの本文に記載されている通り、ガス比質量分析計を用いて、これらの大気中二酸化炭素サンプルのラベル化炭素濃縮を分析します。ここでは、生きたOP 50 E. coliまたはUV照射で死滅させたOP 50 E. coliを餌として与えた虫体において、大気中の二酸化炭素および虫体内の溶解二酸化炭素で測定されたラベル化炭素により、若成虫への安定同位体の取り込みが2時間後に十分に行われていることが示されています。炭素13二酸化炭素と炭素12二酸化炭素の比率は、放出された大気中の二酸化炭素と比較して、虫体内の溶解二酸化炭素画分でより高い値を示しました。幼虫期から安定同位体に長時間曝露させ、その後、細菌を含まないNGMプレートで虫体を洗浄することで、若成虫における遊離グルタメートの同位体濃縮が増加することが観察されました。

このグラフにおいて、L1は、L1幼虫期から若成虫期の959細胞段階まで、普遍的に標識された13CグルコースおよびOP50細菌を給餌した線虫を表しています。YAは、産卵開始1日目の若成虫期に達した時点から48時間、13CグルコースおよびOP50細菌を給餌した線虫を表しています。X軸は各グルタミン酸種の標識炭素原子の総数を示し、Y軸は濃縮率（%）を示しています。すべての個体は、後続の試料調製前に、過剰な同位体標識を洗浄して除去しています。

GCMS分析において、緑色のバーは、PCA抽出の2時間前にNGMプレート上のOP 50 E. coliを給餌して同位体曝露を行い、その後洗浄した虫を示しています。青色と灰色のバーは、同位体曝露の時間経過に関わらず、PCA抽出の前に細菌を含まないNGMプレート上でそれぞれ2時間または6時間同位体曝露を行い、その後洗浄した虫を示しています。動物をプレート上で2時間または6時間洗浄した際、中間代謝物の同位体濃縮に有意な差は見られませんでした。

いずれの同位体曝露コースにおいても、動物に2時間、未標識の細菌を給餌して洗浄（クリアリング）を行った場合、中間代謝物における同位体濃縮度が低下することが観察されました。したがって、同位体を含む細菌塗布NGMプレートで育成した線虫において、中間代謝物の濃縮率を最適化するための最適な洗浄プロトコルは、未塗布のNGMプレートで2時間洗浄することであると決定されました。これは、細菌を含まない1個の6炭素13グルコースを含む液体培地で24時間処理した後に行われます。

この図に示すように、超音波処理のみで行った破壊と、超音波処理に粉砕を加えた破壊による線虫サンプルの比較を行いました。超音波処理と粉砕を併用して破壊した線虫は、超音波処理のみで破壊したサンプルよりも高い同位体濃縮を示しました。最終的に、L1段階からのプレート上での発育中、または若成虫として液体培地中で産卵初日から24時間、安定同位体前駆体を生存線虫に投与しました。これにより、発育後の解糖系およびトリカルボン酸サイクルにおけるピルビン酸代謝のフラックスを示す代謝物の同位体濃縮について、感度の高い分析が可能となりました。

この手法は、C. elegansにおける中間代謝フラックスを探索するミトコンドリア疾患研究への道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、線虫C. elegansにおける中間代謝の安定同位体プロファイリングおよび代謝フラックスの測定方法について十分に理解することができます。