基本的な

このビデオでは、C. elegansをL1期で同期させる方法を説明します。これは非常にシンプルながら一般的で、初心者の方にとっても非常に有用な手法です。

C言語のエキスパートであれば、このプロトコルを最適化するためのヒントをここに見つけられるかもしれません。線虫の同期化の基本は、成虫と胚におけるアルカリ性次亜塩素酸溶液に対する相対的な耐性の差に基づいています。多くの胚を体内に持つ成虫を次亜塩素酸溶液でインキュベートすることで、成虫のみを死滅させ、胚だけを残します。

同期の第2段階は、餌を枯渇させることで達成され、これにより、胚が異なるタイミングで付着しても、L1期より先に成長しないようにします。ブリッツングプロトコルを開始するための最初のステップは、虫が産卵段階にあり、プレート上にいくつかの卵が散在している状態にすることです。M9を用いて成虫を回収し、採取してください。

また、プレート表面にすでに移動している胚は、X線フィルムなどの柔らかい素材で掻き取り、数回のM9洗浄で回収した細菌を洗い流します。通常は2回程度で十分です。線虫の洗浄が完了したら、好みに応じて、あらかじめ調製しておいた新鮮な漂白溶液を添加します。

チューブを振盪しながら、インキュベーション時間を制御します。実体顕微鏡下で成虫の発生を確認してください。死骸がほとんど見られなくなった時点で、チューブが満杯になるまでM9バッファーを加えて反応を停止させます。

プロトコルを完了させるために、少なくとも3回の洗浄を行ってください。M9バッファーを用いて、卵をオーバーナイトで連続的に振盪しながらインキュベートします。これにより、孵化は促進されますが、線虫のさらなる発育は抑制されます。同期化は15°Cから25°Cの間のどの温度でも可能ですが、15°Cが推奨されます。

発生速度が遅いため、またその発生過程で述べたように、C. elegansは成体になるまでに4つの幼虫期を経ますが、その期間は飼育温度によって異なります。タイプCのC. elegansは15から25度の成長温度に耐えますが、温度が高いほど成長速度は速くなります。

こちらの高温域では、24時間後にワームの到達段階に違いがあることがわかります。15度と25度の場合、25度で48時間経過すると、すでに胚が観察されます。しかし、プレート表面に胚が見られるまでには、80時間以上待つ必要があります。

最適な結果を得るために線虫を15 °Cで育成する場合、ブリッツング（blitzing）実験を行う際にはいくつかの注意点があります。また、実験に使用する適切な段階の線虫を識別することも重要です。そこで、サイズ、微分干渉コントラスト顕微鏡、または染色によって、線虫のステージを区別する方法を説明します。

このグラフから、GaNワームの成長速度が温度に応じて変化することが分かり、25度でより速く成長することが示されています。海洋生物においては、個体の大きさと発達段階の間に相関関係があります。適切なソフトウェアを用いることで、個体を測定し、適切な発達段階に分類することが可能です。

しかしながら、このグラフからわかるように、部位は発生段階の粗い指標にすぎません。より合意を得やすいステージングは、微分干渉コントラスト顕微鏡またはDAPI染色によって認識・利用可能な種子の部位や解剖学的構造を観察することで達成できます。当研究室では、このプロトコルを用いて、単染色での微小卵の同期、in situ 可視化、およびDAPI染色などのさまざまな実験のために線虫を同期させてきました。

さらに、本プロトコルはコンタミネーションの除去にも役立ちます。コントラストを強調するために、微分干渉（DIC）顕微鏡またはNOMAR顕微鏡を使用します。染色していない透明な試料の場合、動物を2% Agrosの上に生きたまま固定します。Agrosは事前に調製し、必要になるまで4°Cで保存することが可能です。

これを融解させ、65°Cで保持します。Agaroseが融解したら、スライドグラスにテープを貼り、それを3枚目のスライドグラスの両側に配置します。慎重にAgaroseを少量取り、テープを貼っていないスライドグラスの上に1滴滴下します。

もう一枚のスライドガラスを横向きに重ねて、アガロースを覆います。パスが固まったら、一方のスライドガラスをもう一方の上に慎重に滑らせて、2枚を切り離します。パッドはそのうちの一方に付着します。

線虫を固定するため、パッドの上にAmazonを少量加えます。解剖顕微鏡下で線虫を数匹選び、leleの滴に転移させます。この際、pathを損傷させないように注意してください。

カバーガラスを取り、そのエッジにネイルポリッシュを塗布します。気泡が形成されないように注意しながら、このスライドの上にカバーガラスを慎重に配置します。この標本は、直ちに顕微鏡下で観察することが可能です。C. elegansの解剖学的構造において、最も観察しやすい特徴の一つが咽頭です。

例えば、クリスマスツリーのような形状のaavaはL4ステージの特徴です。発生過程におけるc elganの解剖学に関する詳細な情報は、www.orla.orgから得ることができます。個々の細胞を同定するためには、Tapis染色が一般的な手法として用いられます。

トンネル固定法は、線虫を迅速に固定するための手法です。DAPI染色を行うには、まず顕微鏡スライドガラスの表面にM9バッファーを1滴加えます。プレートから線虫を直接ピックアップし、M9バッファーの滴に移します。

ピペットまたは柔らかいティッシュを使用して、過剰なM9を除去します。線虫にトンネルを追加します。この操作を繰り返します。

最初の液滴が乾いたら、APIとオーバースリープを含む封入剤を加え、顕微鏡で観察します。APIを加えた温かい状態で、goの展開を容易に観察することができます。