高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

従来、細胞レベルの解像度で顕微鏡分析を必要とする生物学的および臨床的研究では、複数の実験を並行して行い、評価のために各タイムポイントで個別のサンプルを採取して光学顕微鏡で観察してきました。一方、共焦点顕微鏡、マルチフォトンプローブ、および第二高調波発生顕微鏡はいずれもin situイメージングに有用な手法ですが、走査レーザーシステムや複雑な光源を必要とするため、必要なインフラが複雑で高価になります。本稿では、市販のコンポーネントを使用し、5,000米ドル未満の費用で、高解像度光ファイバーマイクロ内視鏡システムをわずか1日で構築する方法を実証します。

このプラットフォームは、画像解像度、視野、および動作波長の面で柔軟性を備えています。まず、光源、光学フィルタ、レンズ、光ファイバーバンドル、およびCCDカメラを搭載するために、シンプルな落射蛍光顕微鏡のフレームを組み立てます。次に、CCDカメラ上に光ファイバーバンドルの拡大像を形成する結像レンズを設置します。

次に、試料に蛍光励起光を照射するため、照明光学系を備えたLED光源を設置します。最終的に、組み立てたマイクロエンドスコープを用いてリアルタイム撮像を行うことで、in vitro培養、in vivo動物モデル、およびヒト被験者を含む、蛍光標識された試料の細胞レベルの詳細を明らかにします。共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、十分に簡便かつ安価であるため、多様な分野の研究者が迅速に導入し、それぞれの特定のニーズに合わせてカスタマイズできる点にあります。

本稿で述べる高解像度マイクロエンドスコープは、組み立てや用途においていくつかのバリエーションが可能な基本構成として検討されるべきです。特定の用途に向けてコンポーネントを選択する際は、蛍光顕微鏡における蛍光物質の濃度、光退色を誘発する照明、強度、カメラの感度、ゲイン、および露光時間の間に存在する固有の関係性を考慮してください。本プラットフォームは、蛍光造影剤としてpro flavinを使用するように設計されていますが、他の蛍光色素で動作するように構成することも可能です。

Pro flavinは、最大吸収波長445 nm、最大蛍光波長515 nmを持つ明るい核染色剤です。他のコントラスト剤を使用する場合は、マイクロエンドスコープシステムを構築するために、適切な励起・蛍光フィルターおよびダイクロイックフィルターを選択する必要があります。まず、2本の6インチケージロッドを2本の1.5インチケージロッドに接続し、一対の長さ7.5インチのロッドを作成します。ロッドをフォールドミラーユニットの一方の面にねじ込み、次に直径1インチのミラーを取り付けます。

次に、0.5 inchのロッド4本をフォールドミラーユニットの反対側の面にねじ込みます。2つの下部貫通穴を介して、ケージキューブを7.5 inchのケージロッドにスライドさせます。2 inchのロッドをケージキューブの側面面にねじ込みます。

CマウントからSM1への変換アダプターを使用して、カメラをケージプレートに取り付けます。ケージプレートを0.5インチのケージロッドに固定し、フォールドミラーユニットの前面と面一になるように調整します。1インチ径のチューブレンズを選択し、ファイバー光学束の像をカメラ上に結像させます。

レンズの焦点距離は、ファイバー optic バンドルのコアが少なくとも2ピクセルでサンプリングされるように選択してください。カメラで結像させる際、レンズを3インチの長さのレンズチューブに挿入し、リテイニングリングで固定します。長いレンズチューブにリテイニングリングをねじ込む際は、スパナレンチを使用すると便利です。

エミッションフィルターを3インチレンズチューブに入れ、1つ目のリテーニングリングの上に載せ、さらに別のリングを加えてフィルターを固定します。フィルターの向きが、フィルターメーカーの指定する基準に従っていることを確認してください。レンズチューブを、CCDカメラに最も近いケージキューブの側面にねじ込みます。

この位置についてもここに示されています。図では、このレンズとフィルターは3インチのレンズチューブなしで表示されていることに注意してください。明確に確認するため、カメラをコンピュータに接続し、画面上で画像を確認してください。

ケージアセンブリを遠くの物体に向け、物体の像にピントが合うまで、ケージキューブをレールに沿ってスライドさせます。ドライバーを使用して、ケージキューブの側面にある4本のネジを締めます。これらのネジを締めるとレールが固定され、キューブが所定の位置に保持されます。

これにより、無限遠補正対物レンズと組み合わせた際に、チューブレンズがカメラ上にファイバーバンドルの集光像を形成することが保証されます。次に、ダイクロイックミラーをホルダーに挿入し、ケージキューブ内に45度の角度で配置します。RMS-SM1ネジ変換アダプターと調整可能なレンズチューブを介して、対物レンズをチューブレンズホルダーとは反対側のケージキューブ面にねじ込みます。

その後、SMAコネクタをケージプレートにねじ込み、これを対物レンズの作動距離とおよそ同じ位置になるようにロッドに取り付けます。ケージキューブの開いた側面にベースプレートとエンドキャップを取り付けます。次に、LEDをケージプレートに取り付け、2インチロッドの端にスライドさせて装着します。

0.5インチのレンズチューブにレンズを取り付けます。このチューブをケージキューブの側面にねじ込んだ際に、LEDの像が対物レンズの後方開口部を十分に満たすように調整してください。また、励起フィルターもレンズチューブに取り付けます。この段階で、エポキシ樹脂を用いてLEDドライバーを固定し、照明光強度を制御できるようにします。

1030 µmファイバー用のSMAコネクタを、720 µm視野のファイバー光学バンドルに取り付けます。ファイバー光学コネクタの作成に関する詳細は、Thorlabsのパーツ番号FN96「光ファイバーのコネクタ化および研磨ガイド」を参照してください。

SMAコネクタ付きのファイバ束を、ケージロッドに取り付けられたSMAレセプタクルにねじ込みます。ファイバ束の遠位端を広帯域光源に向けます（蛍光灯でも十分です）。次に、CCDカメラでファイバ束近位面の画像を確認します。最後に、対物レンズをケージキューブにねじ込むか緩めることで、その位置を調整します。

ファイバーバンドルの画像にピントが合うまで、個々の原因が明確に見える必要があります。マイクロエンドスコープの空間分解能は、ファイバーバンドルの先端にマイクロレンズまたはレンズアセンブリを取り付けることで向上させることができます。これらの光学系は、バンドルの先端を組織に直接配置するのではなく、拡大倍率を用いて組織表面に先端を投影するように構成されています。

これにより、ファイバーバンドルの導光によって制約される空間サンプリング周波数を向上させることができます。拡大倍率が高くなるほど空間分解能は向上しますが、同時に視野は比例して狭くなります。用途に合わせて、希望の倍率と作動距離を持つGRINレンズを選択してください。

レンズの直径が、使用予定のファイバーバンドルの直径と一致していることを確認してください。正確なアライメントを行うため、低倍率顕微鏡または実体顕微鏡の下で、ファイバーバンドルとGRINレンズをそれぞれ独立した3軸手動ポジショニングステージに取り付けます。

次に、レンズまたはファイバーバンドルの端面のいずれかに、光学用接着剤を1滴滴下します。マニュアルポジショナーを使用して、これら2つのコンポーネントを接触させます。接着剤を硬化させるため、メーカー推奨の照射量で界面にUV光を照射します。

GRINレンズと接合界面を保護するため、短く切断したアルミニウムキャピラリーチューブを使用して接合部を囲みます。チューブを接合部に被せ、チューブの両端にエポキシ樹脂を少量滴下して固定し、熱収縮チューブを用いて組み立てを完了させます。マイクロ内視鏡イメージングを行う前に、イメージング対象となる細胞または組織に造影剤を投与し、細胞や培養物のイメージングを行います。

まず、ピペットで培地を除去します。次に、プロフラビン溶液をウェルに静かにピペッティングして加えます。最大1分間の短時間のインキュベーション後、ピペットでプロフラビン溶液を除去し、廃棄します。

ウェルに新鮮なPBS溶液を加えて除去し、細胞を洗浄します。安定性を確保するため、ファイバーバンドルの遠位端を、x、Y、Z軸に手動ポジショニングステージを備えた固定器具に固定します。細胞または組織に色素を適用した後のイメージングでは、ファイバーオプティックバンドルをサンプルに軽く接触させます。カメラメーカー提供のソフトウェア、または独自に開発したカスタムソフトウェアを使用して、コンピュータ画面上でファイバーオプティックバンドルの画像を確認します。

カメラの露光時間とゲイン設定を調整し、適切な明るさの画像が得られるようにします。正しく組み立てられたマイクロエンドスコープは、コヒーレント光ファイバー束を介して中継されたエピ蛍光顕微鏡として機能します。最適なイメージング結果を得るためには、3つの重要な条件が満たされているかを確認する必要があります。

まず、システムのフル解像度を得るために、ファイバーバンドルの近位端面をデフォーカスさせずにCCDカメラに結像させます。ここでは、ファイバーバンドルの一部を、不十分なピント、わずかに合ったピント、および最適なピントで結像させています。最適ピントは、バンドル端面に対する対物レンズの実際の位置を調整することで決定します。

次に、ファイバーバンドルの近位端面がその全径にわたって均一に照射される必要があります。前述のように、これは照明光学系をコリメート照明に設定することで実現します。ここに示す画像は、均一な蛍光サンプルをこの推奨構成で照射した際に取得したものです。

臨界照明下での対応する結果をここに示します。LEDの構造がファイババンドルの端面に結像し、その結果、本来の試料構造にこの不要なパターンが重なって現れています。第三に、ファイババンドルの近位端面と遠位端面の両方が清潔であり、傷や欠けがないことを確認することが重要です。

この例では、画像上のゴミがバンドル面に付着しており、ファイバー外周の5時方向に小さなチップ状の損傷が見られます。バンドル面のゴミは、レンズペーパーとイソプロパノールを用いた従来光ファイバーコネクタと同様の洗浄方法、または標準的な光ファイバークリーニングツールを使用して除去できます。1483個の細胞をプロフラビンで標識し、ベアファイバーバンドルをサンプル上に軽く配置しました。

2.5倍のGRINレンズをバンドル先端に接合した際の外的なイメージングがここに示されており、空間分解能の向上と視野の縮小が達成されました。この動画に見られるように、外径0.5 mmのファイバーバンドルを21ゲージの針に通し、マウスの乳腺脂肪 패드組織内に挿入して生体内イメージングを行いました。心周期に伴う動きと共に、脂肪細胞が鮮明に観察されます。この例では、外径1.5 mmのより大きなファイバーバンドルを用いて、健康なヒトボランティアの口腔粘膜のイメージングを行いました。

すべての例において、核標識蛍光コントラスト剤としてpro flavinが使用されました。このビデオを視聴することで、細胞および組織のin vivo蛍光イメージング用光ファイバーマイクロエンドスコープの設計および組み立て方法について、十分に理解できるはずです。