ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

このビデオでは、標準的な市販部品を用いてビデオレート走査共焦点顕微鏡を構築する方法を実演します。走査共焦点顕微鏡は、2つの走査ミラーの協調動作によって、ビームをラスタ面上で移動させる仕組みに基づいています。最初のミラーからの光は、第1リレーレンズセットを介して水平方向に走査され、第2走査ミラー上の固定点に再び集光されます。その後、同様の走査動作が走査レンズおよびチューブレンズを通じて伝達され、拡大された光ビームが対物レンズの背面開口部に照射されます。

1枚目のミラーに比べて低速で動作する2枚目のミラーがY軸を同時に走査することで、図示した平面の上方および下方への走査が可能となり、試料表面に矩形のラスタを作成します。市販の顕微鏡を購入する場合と比較して、本プロトコルの主な利点は、低コストであることと、イメージングプロジェクトの特定のニーズに合わせて装置をカスタマイズできることです。あらゆるレーザーを使用する際は、眼への損傷を防ぐために適切な安全対策を講じることが不可欠です。

可能な限り、常に適切なレーザー保護メガネを着用してください。ビームの調整や操作に直接関与していない見学者や研究者も、必ずメガネを着用してください。光沢のある時計や反射しやすいジュエリーはすべて外してください。

最も重要な点として、ビームブロックや固定した名刺を用いてビームの経路を遮断し、常にビームを追跡し制御するようにしてください。これは、ビームの経路を予測するのが困難なミラーのアライメント中に特に重要です。また、絶対に目をビームの経路と同じ高さにしないでください。

顕微鏡を組み立てる前に、ビームの経路を横切る必要がある場合はレーザーの電源を切ってください。光学ブレッドボードと90度ブラケット、すべてのミラー、レンズ、ダイクロイックミラーに加え、適切なクランプと取付金具、2枚のスキャンミラー、および光検出器など、構築に必要なすべての装置が揃っていることを確認してください。また、アライメント中にスキャニング動作のテストやミラーの操作を行うため、ファンクションジェネレーターを手元に用意しておくと便利です。

安定性を高めるため、ブレッドボードをボルトで固定することを強く推奨します。顕微鏡の組み立てを開始するには、ピグテールファイバーアトーを光学マウントに装着し、このアセンブリを光学ブレッドボードの中央に配置します。これは、ここに示されている青色ビームの起点に相当します。

光源を点灯させます。調整ネジを使用して、ビームが水平および垂直の両方向に直線的に進むように大まかに調整してください。ファイバーコリメーターの前面にアイリスを配置します。

次に、ビームが中心を通るようにアイリスの高さを調整します。その後、ビームパスに沿ってアイリスをATORから遠ざけます。ビームのアライメントを確認してください。

必要に応じて、2本の調整ネジを使用してアイリス上のビーム位置を調整します。マウントした二色性ミラーをビーム光路上に配置し、レーザービームがミラーの中心に位置するようにします。ビームの高さが変わらないように注意しながら、ミラーホルダーを回転させてビームを約90度に反射させます。

マウントのネジを締めて、ミラーをテーブルに固定します。次に、マウントした共振ガルバノメトリックミラーをレーザー光路内に配置します。この際、レーザー光がミラー表面の正確な水平中心に位置するように注意してください。

ミラーマウントを回転させ、レーザービームを90度の角度で反射させます。次に、ミラーによる反射を粗調整し、レーザービームの垂直方向の高さを維持します。続いて、2つのアイリスを用意し、共振ガルバノミラーの直前に配置します。

次に、共振ガルバノミラーで反射したレーザービームを基準にして、これまでと同様に垂直方向の高さを設定します。次に、光学ブレッドボード上のネジ穴を目安にして、2つのアイリスを直線状に固定します。経路上の最初のミラーであるダイクロイックミラーを調整し、最初のアイリスの中心にビームを合わせます。

次に、光路上の2番目のミラーを調整します。2番目のアイリスでビームを中央に合わせるために、共振ガルバノミラーを調整してください。ビームが両方のアイリスを通過して整列するまで、これら2つのミラーを繰り返し調整します。

共振ガルバノミラーで反射したレーザービームが、引き続き近似的なミラーの中心で反射していることを確認します。ビームが逸脱している場合は、ファイバーコリメータのマウントを調整し、ビームが両方のオープンアイリスの中心にくるように調整を繰り返します。次のステップは、最初の固定テレセントリック面を2番目の固定テレセントリック面に結像させるための、2枚のリレーレンズを配置することです。

この顕微鏡では、第1リレーで選択したレンズの焦点距離が等しくFであるため、2つのミラー間の距離は単純に4Fとなります。この構成では、Fは90 mmであるため、4Fの位置は走査ミラーから360 mm離れた場所になります。レンズがビームパスの中心に正確に配置されるようにするため、まず第1レンズをビームパスに設置し、ビームパス上の次のアイリスに投影されたレーザービームのスポットを確認します。レンズの設置後、ビームの垂直方向の中心がアイリスの中心に一致するようにレンズの高さを調整してください。

次に、水平ビームの位置を調整し、ビームをアイリスの中心に合わせます。この手順を2枚目のレンズでも繰り返します。続いて、スキャンミラーを設置し、顕微鏡を回転させます。これにより、通常であれば垂直方向に調整が必要な部品の配置とアライメントを、より容易に行うことができます。

2番目のテレセントリック面の正確な位置を特定するために、共振ガルバノメータをスキャンユニットに接続し、電源を入れます。名刺を使用して、2つのレンズを通過するスキャンビームの経路を追跡してください。2番目のテレセントリック面は、共振ガルバノメータから約4Fの位置にあり、スキャンビームが静止して見える位置として特定できます。

この場所の下にあるブレッドボードに鉛筆で印を付けます。テレセントリック面を特定したら、スキャニングミラーの入力を0 Vに設定し、ミラー制御ハードウェアの電源を入れ、ミラーをニュートラルポジションに安定させます。その後、標準のスキャニングGalilミラーをテレプレーンの正確な位置に配置します。

テレプレーンにおけるビームがスキャニングミラーの正確な中心に当たるようにミラーの位置を調整し、ミラーマウントを締め付けます。次に、ガルバノミラーを固定しているロックネジを緩めて回転させ、ビームが垂直に伝搬していることを確認します。その後、レーザーとスキャニング電子回路の電源を切ります。

ファイバーとスキャンミラーを取り外します。次に、90度ブレッドボード用マウントブラケットを使用して、2枚目のブレッドボードを1枚目に固定します。

最後に、新しいブレッドボードが水平になるように顕微鏡全体を慎重に回転させ、クランプを使用して顕微鏡を固定します。ここでgal oとレーザーを再接続し、gal Oを0 Vに戻すことを忘れないでください。以前は垂直に設置していた残りのセットアップは、水平なブレッドボード上で容易に実施できます。

次に、正式にはスキャンレンズおよびチューブレンズと呼ばれる2組目のリレーレンズを設置します。適切なレンズの組み合わせを選択するための非常に重要な情報については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。まず、レンズの設置から開始します。

まず、ビームを対物レンズに導くために必要なミラーを配置します。最初の2インチの大型ミラーをブレッドボードの端に近づけて設置し、ミラーマウントを回転させてレーザービームを概ね90度方向に反射させます。ミラーでの反射を調整し、ビームの垂直方向の高さを一定に保ってください。

次に、もう一つの2インチミラーをブレッドボードの反対端に配置して、ビームを90度の角度に方向づけ、調整ネジを使用して固定します。続いて、2つのアイリスを設置し、前述と同様に2つのミラーを調整してビームを中心に合わせます。その後、ビーム光路上のgalから焦点距離の位置にスキャンレンズを配置し、その水平および垂直方向の位置を調整します。

レーザースポットを2枚のミラー間にある最初のアイリスの中心に合わせます。2インチの大型チューブレンズをスキャンレンズから適切な距離に慎重に配置し、水平および垂直方向の位置を調整して、ビームを最初のアイリスの中心に合わせます。このセットアップでは、すべてのコンポーネントを配置した状態で、チューブレンズを75 millimetersに300 millimetersを加えた距離に配置します。

gal Oを標準的な電気関数発生器または制御回路の出力に接続し、ピーク間電圧を1〜3 Vに設定します。次に、名刺を用いて2つのミラーのスキャンを開始します。チューブレンズから300 mm後の固定平面でレーザービームの位置を確認します。

対物レンズを光路に配置し、対物レンズの後方開口部ができるだけ定在面に近づくように配置します。サンプルステージをセットアップし、Z軸の移動マウントが全可動範囲内で対物レンズのマウントに接触しないことを確認してください。共焦点顕微鏡、ピンホール、および検出器をセットアップするには、まずすべての電源と光ファイバーを切り離します。

顕微鏡アセンブリを回転させ、共振走査ミラーを保持した状態で再びブレッドボード上に設置します。ファイバーをコリメータおよび標準走査ミラーに再接続し、電源、供給、および制御ケーブルを接続した後、ステージ上の標準走査ガルバノメータを駆動する制御電圧に、前と同様に0 Vを印加します。2枚のカバーガラスの間に挟んだ明るい染料のサンプルを配置します。次に、レーザー光源をオンにし、染料に焦点を合わせます。

名刺を用いて、蛍光が最大限に明るくなるようにレーザー出力を調整します。サンプルからの蛍光放出が、対物レンズ、走査システムを経て、レーザー光を反射し蛍光放出を透過させるダイクロイックミラーに到達する経路を辿ります。ダイクロイックミラーの反対側で、この蛍光信号を確認してください。

ここで室内の照明を落とします。ダイクロイックミラーの後方にミラーを配置し、エミッションを90度の角度で反射させます。次に、ミラー付きのアイリスを用いて、蛍光ビームをブレッドボードに対して可能な限り直線かつ平行に導きます。

次に、Thor Labs社の空間フィルタケージマウントアセンブリを使用して、共焦点ピンホールユニットを設置します。この図にセットアップの概略を示します。スキャニングミラーは、固定の対物レンズに対してテレフォーカス位置にある固定平面に配置されます。

固定面の間にある後方開口面のレンズペアは、走査ビームを中継する役割を果たします。最初のレンズペアは等しい焦点距離を持ち、1対1の望遠鏡を構成します。正式に走査レンズおよびチューブレンズとして知られる2番目のレンズペアは、焦点距離が等である必要はなく、多くの場合、対物レンズの後方開口面がオーバーフィルされるようにするためのビーム拡大望遠鏡として機能します。

試料から放出された光は、スキャニングシステムを逆方向に通り、ダイクロイックミラーを透過します。短焦点レンズまたは対物レンズによって、放出光が共焦点ピンホールに集光され、その後レンズでコリメートされます。最終的なレンズにより、共焦点フィルタリングされた放出光が光電子倍増管に集光されます。

空間フィルタユニットをエミッションビームの光路上に配置し、第1集光レンズのマウントがエミッションビームの中心にくるように注意して調整します。ここでは、ピンホール径 100 microns の空間フィルタユニットを選択しました。次に、短焦点レンズをユニットに取り付け、ピンホール表面に明確な焦点が見えるまでZ軸移動マウントをスライドさせます。

ユニット全体が蛍光ビームの直線に沿って配置されていることを確認します。ユニットをブレッドボードに固定してください。次に、移動ステージの調整ノブを使用して2軸を調整し、ピンホールマウント表面で2次元探索を行い、ピンホールを通過する蛍光信号が最大となる点を探します。

次に、ピンホールの後のケージマウントにコーティングレンズを配置します。名刺を使用して、共焦点ユニットを通過する蛍光イオンを確認し、放出される蛍光が可能な限り集光されるまで、ポストに沿ってコーティングレンズをスライドさせます。光電子増倍管アセンブリをセットアップします。蛍光放出光路に焦点距離 50 millimeter のレンズを配置し、その焦点を確認します。

ブレッドボード上のこの位置に印を付けます。次に、レーザーを完全に消灯し、光電子増倍管の窓が、印を付けた焦点にできるだけ近づくように配置します。その後、調節可能なレンズチューブを使用して、アセンブリを集光レンズに接続します。

ピンホール以降の露出しているすべてのビームパスに遮光テープを巻き、レーザーの出力を極めて低く設定して電源を入れます。オシロスコープで電圧を確認しながら、光電子増倍管を慎重に起動します。レーザー強度を上げながら、オシロスコープの画面にスパイク状の読み取り値またはDCオフセットが表示されるまで電圧を上げます。

レーザー出力をオフにするか、ビーム光路を遮断して信号が消失することを確認し、この信号が確かに蛍光によるものであることを確認します。最後に、オシロスコープで信号が最大になるようにピンホールの位置を繰り返し調整します。まず集光レンズのZ位置を操作し、次にYZ移動ステージを調整することで、ビデオレート顕微鏡のハードウェア構成が完了します。

まず、光電子増倍管の電源を切ります。次に、付属の書面プロトコルの図に従って、ミラーのカスタム制御ボードとコンピュータを接続します。このシステムは、共焦点走査型マイクロエンドスコピーの実施に適応させることが可能です。

ステージをファイバー保持ステージに置き換える手順については、付随するテキストまたは詳細を確認してください。完成した正立共焦点走査型顕微鏡とマイクロエンドスコープは、ここに示すようになります。レーザー光および放射光は、視覚的なガイドとして描かれています。

マイクロエンドスコピー操作では、実験時にイメージファイバーを固定するためにファイバーマウントが使用されます。このファイバーマウントは、用途に応じてXYステージに容易に交換することが可能です。ここに示されている正立顕微鏡プラットフォームは、ビデオレートフレームグラバーカードを用いて入力信号から画像を生成し、白い名刺に印字された小文字のMを撮影した代表的なテスト画像です。漂白済み。

白色の紙にはUV光や青色光で容易に励起される蛍光物質が含まれており、暗い部分の背後に明るい背景が生じます。この蛍光放出を収集するために、Mレターおよび515 nanometersを中心とするエミッションフィルターを選択しました。特に画像フレームの側端付近で、わずかな画像の歪みが観察される場合があります。

この歪みは、8 kHzのgvoミラーによる正弦波スキャンパターンに起因するものであり、付属の資料で詳細に説明されています。この動画では、ビジネスカードをスキャンして得られたサンプルビデオレートデータを示しています。この動画を視聴することで、ビデオレート共焦点走査型顕微鏡の構築およびアライメント方法について十分に理解できたはずです。

レーザー光を用いた作業は極めて危険であるため、本手順の実施中は、反射性のジュエリーをすべて外すことや、ビームラインと目の高さを合わせないようにすることなど、常に十分な予防措置を講じてください。