膜電位、シナプス応答、神経回路、ニューロモデュレーションとザリガニを使用して筋肉の組織学：学生研究室の演習

以下の一連の実験の全体的な目的は、興奮性膜の特性と静止膜電位のイオン的基盤を理解し、膜電位の測定方法を習得すること、およびシナプス伝達の特性を実証することである。実験の一方では、細胞外カリウム濃度を変化させながら静止膜電位を測定する。また別の実験では、さまざまな運動単位における刺激誘発性のシナプス応答を記録することにより、シナプス分化のメカニズムを調査する。

次に、維持が容易な神経回路を紹介します。この調製法は、感覚器から中枢神経系（CNS）、運動ニューロン、そして筋肉へと至る回路のさまざまな側面に関する研究だけでなく、教育目的でも利用可能です。一連の実験により、膜電位、シナプス統合と伝達、および筋線維型の構造的な違いに関する課題に取り組む上で、ザリガニモデルがいかに有用であるかが示されます。

電気生理学的な概念と手法を教える上で、ザリガニの標本を用いる主な利点は、解剖が容易であること、最小限の生理食塩水で標本の生存能を維持できること、シナプス応答を得やすいこと、そして筋肉の全体的な解剖学的配置を判別しやすいことです。これらの手法は他の標本にも適用可能であり、シナプス生理学と変調に関する理解を深めるとともに、実演した標本の生化学的および構造的な違いについての知見を広げることができます。手術を開始するには、体長約 6 to 10 cm のザリガニを選び、砕氷の中に 5 分間置いて麻酔をかけます。ザリガニの頭部を切除するには、大きなハサミを使用し、指がザリガニのハサミや口に届かないように注意しながら、頭の後方を持って固定してください。

ザリガニの目の後ろ側からきれいに切断して速やかに頭部を除去し、怪我を防ぐために脚と鉗子脚を取り除きます。雄の生殖肢（style）および雌雄両方の遊泳脚を取り除きます。除去した頭部と付属肢は廃棄してください。

次に、腹部と胸部をつなぐ関節膜に沿って切り込みを入れ、腹部を胸部から切り離します。ザリガニの腹部を保存し、胸部は廃棄してください。ハサミの先を腹側へ向けてわずかに傾け、腹部両側の外側下縁に沿って殻に切り込みを入れます。このとき、ザリガニの体に深く切りすぎないように注意してください。

ピンセットを使用して、ザリガニの各節の長さに沿った甲殻の自然な走行線に従います。腹部の筋肉を傷つけないように注意しながら、甲殻の腹側部分を上に持ち上げて後ろに引くことで取り除きます。

屈筋を除去します。この時点で、深指屈筋の上に白い組織の塊が見えます。この組織をピンセットで慎重に除去してください。

深指屈筋の正中線に沿って、胃腸管（GI tract）が小さな管として見えます。ピンセットで上部を挟み、腹部から引き離して除去してください。その後、尾の末端で胃腸管の下部を切断します。

解剖部位を生理食塩水で洗浄し、糞便などの老廃物が標本の調製を妨げないようにします。解剖用ピンを用いて、標本の上下の角をSガードコーティングされたペトリ皿に固定します。これで腹部伸筋が露出します。

細胞内記録を行うまで、標本が浸るようにペトリ皿に生理食塩水を注ぎます。ペトリ皿を顕微鏡上に移動させ、皿の下にワックスを敷いて固定し、動かないようにします。細胞内記録に使用する装置はこの図に示されています。

適切な接続方法および設定については、付随するテキストに記載されています。指示に従ってラボチャートソフトウェアをセットアップしてください。付随するテキストに従い、接地線を生理食塩水バスの中に配置します。

3 Mの塩化カリウムを満たしたガラスマイクロピペットの先端を生理食塩水バスに入れ、電極抵抗を測定します。電極抵抗は20～60 MΩである必要があります。アンプの粗調整ノブを使用して、高強度照明下でラボチャート上のラインをゼロに移動させます。

顕微鏡を覗き、縦方向のDEM筋を特定します。電極プローブを用いて、DEM筋の筋線維に細胞内電極を刺入します。電極は筋線維にわずかに刺入するようにしてください。

細胞を完全に貫通させないように注意してください。静止電位の振幅を測定します。チャートウィンドウの左下隅にある位置から、Mカーソルをトレース上にドラッグしてください。

マーカーMを基線上に配置し、カーソルを記録された信号の最低点まで移動させます。マーカーとアクティブカーソルの差が画面の右上に表示されます。この値が静止膜電位の電圧となります。

記録された電圧を増幅倍率で割ります。この場合は10倍の増幅が使用されました。次に、電圧をボルトからミリボルトに変換します。その筋線維の静止電位を記録した後、顕微鏡で確認しながら、筋線維から電極を慎重に抜いてください。

他の筋線維で細胞内記録を繰り返します。この実験の次のパートでは、細胞外カリウム濃度の上昇が静止膜電位に及ぼす影響をモニタリングします。カリウム濃度が5.4、20、40、60、80、および100 millimolarの6種類のザリガニ生理食塩水を使用します。

記録の間隔で、次の細胞内記録を行うために、まだ収縮していない筋肉を選択します。浴液を、一段階高い濃度の塩化カリウム溶液に交換します。その際、毎回必ず標本全体が完全に浸るようにしてください。

各溶液における膜電位の変化を記録します。細胞外カリウム濃度を上昇させた際の影響として、膜電位がこのスクリーンキャプチャに示されています。細胞外カリウム濃度を横軸（片対数グラフ）、膜電位を縦軸として、各カリウム濃度における静止膜電位をプロットしてください。細胞外カリウム濃度 5.4 millimolar における静止電位を基準線として揃えてください。

想定曲線と実測曲線を比較し、実測線の傾きを想定線の傾きと比較します。これらの電気生理学的記録を終えた後、次のステップとして、筋線維の解剖学的構造およびその神経支配パターンを検討します。標本をスタンディングディッシュに移し、メチレンブルーを添加します。

5分後、メチレンブルーを除去し、新鮮なザリガニ生理食塩水を加えます。体節内の筋肉を支配する主神経を探します。1つの体節におけるS-E-M-D-E-L 2D EL、およびDEM筋肉への神経支配パターンをスケッチしてください。

次に、準備した試料をドラフトチャンバーの下に移動させます。生理食塩液を取り除き、固定液を加えます。ここではポイン溶液を固定液として使用します。

ドラフトチャンバーを使用する目的は、固定液の蒸気を吸い込まないようにすることです。この溶液が皮膚に触れたり、目に入ったりしないよう十分に注意してください。目に刺激を感じた場合は、すぐに洗眼器で目を洗ってください。

ボイン溶液を標本に約10分間浸し、その後ピペットを用いて溶液を生理食塩水に置換します。DEL 1またはDEL 2筋肉の薄いセグメントを切り出し、スライドガラス上に配置します。

スライドにラベルを貼ります。SEM筋肉についても同様の手順を繰り返します。複合顕微鏡を用いて、両方の組織標本におけるサルコメアの横紋パターンを観察してください。

次の実験シリーズでは、ザリガニの腹部筋肉におけるシナプス応答の記録方法について検討します。別のザリガニを選択し、脱頭します。胸部と肢を除去し、手術の手順に示されているように腹部伸筋を露出させてください。

このビデオの最初のセクションでは、顕微鏡を使用して、伸筋へ向かう運動軸索を含む神経を探します。最も神経にアクセスしやすいセグメントを探してください。神経は白色で、ピペットを用いて生理食塩水を標本に吹きかけるか、標本に軽く息を吹きかけることで視認できます。

これにより神経が動き、特定しやすくなります。マイクロマニピュレーターで保持した吸引電極を神経の直上に配置します。シリンジをゆっくりと引いて、神経を電極内に吸引します。

顕微鏡を通して、電極に神経が吸い込まれる様子を確認できます。付属の記事の指定に従って、ラボチャートソフトウェアの設定を調整してください。3 Mの塩化カリウムを満たしたガラス微小電極を用意し、ヘッドステージおよびPowerLabに接続します。

アンプの粗調整ノブを使用して、ラボチャート上の線をゼロに合わせます。電極を挿入する前に、トグルスイッチを数回オン・オフに切り替えてください。電極の抵抗値をテストするには、得られた値の振幅を測定します。

顕微鏡を覗きながら、電極プローブを用いて、DEMまたはDL1、あるいはDL2のいずれかの縦走筋線維に電極を挿入します。この際、筋線維を貫通させないように注意してください。これで実験の準備が完了しました。

吸引電極を用いて分節神経束を刺激し、ガラスマイクロ電極を用いて筋線維からのシナプス応答を記録します。グラフト刺激装置を起動し、位相性反応を得るために神経を1 Hzで刺激します。次に、電極をSEL筋線維に挿入します。SELは緊張性筋肉です。

緊張性反応を得るために、10 Hzの短時間パルスバーストで神経を刺激します。記録されたDEL筋とSEL筋の反応を比較してください。位相性DEL筋のシナプス反応は、緊張性SEL筋よりも振幅が大きいことに注目してください。

次の実験セットでは、伸筋ではなくザリガニの屈筋に焦点を当てます。新しいザリガニを用い、この手術で示すように腹部を分離します。このビデオの最初のセクションでは、分離した尾の準備試料を生理食塩水で満たしたペトリ皿に入れ、尾と準備試料の上部をピンで固定します。

腹側屈筋を用いたdecarbo実験では、腹側神経索を損なわずに残す必要があることに注意してください。メスを使用して、標本の腹側にある2本の肋骨の間の関節膜に沿って縦方向に切開します。この際、深く切りすぎると運動神経根を断裂させる恐れがあるため、表面の筋肉を損傷しないよう十分に注意して切開してください。

次のステップに進みます。顕微鏡で観察しながら、ハサミまたはメスを用いて、筋肉を覆っている薄い膜層の縦切り部分から水平に切開します。切開部を広げて関節膜のフラップを作り、そのフラップを上方に持ち上げます。

ハサミを用いて、表層屈筋からの細胞内記録を行うために、表層屈筋を露出させるフラップを切除します。静止膜電位および腹伸筋からのシナプス応答の記録に使用したものと同じ器具とセットアップを使用してください。 l前述と同様に、3 molar 塩化カリウムを満たした細胞内電極を使用します。

電極を浅層屈筋の筋線維に挿入します。その際、筋肉を貫通しないように注意してください。EPSPの自発的活動を記録します。EPSPのサイズの違いや、IPSPが存在するかどうかを確認してください。

小さな絵筆を取り、記録電極が含まれているセグメント内のクチクラ縁に沿って慎重に刺激します。もしより大きな反応が見られた場合は、刺激によるEPSPの頻度やサイズの変化に留意してください。これは、感覚神経の発火の変化に反応して、追加の運動ニューロンが動員されたことを示しています。

生理食塩水バス溶液を、1 µM のセロトニンなどの神経調節剤を含む溶液、または二酸化炭素をバブリングした生理食塩水に注意深く交換します。その後、絵筆による刺激を繰り返します。バス溶液の変更が記録された活動に及ぼす影響を確認してください。

バス液の生理食塩水を通常のものに戻し、筋線維の活動がベースラインに戻ることを確認します。この図は、表在屈筋線維で記録されたEPSPを示しています。EPSPの大きさがそれぞれ異なることに注意してください。

この実験の次の段階では、細胞外電極を用いて、感覚神経から中枢神経系（CNS）を経て運動ニューロンへと至る回路の活動に反応する運動ニューロンの活動電位をモニタリングします。まず、感覚神経を刺激するための吸引電極を作製します。プラスチックチューブの一部を炎で加熱して引き伸ばします。

次のステップは、チューブを希望のサイズに切り詰めることです。そのためには、準備した神経を確認し、吸引電極の適切な開口径を判断する必要があります。ザリガニの個体サイズによって、神経束の直径は約1mmから数mmまで異なります。

チューブの伸展した部分をカットし、神経を保持するためのチップ先端の開口部を適切なサイズに調整します。開口部が大きすぎると神経が脱落する可能性があり、小さすぎると電極による圧力で神経が損傷する可能性があります。

プラスチックチューブをガラス製吸引電極の先端に取り付けます。電気生理学的およびソフトウェアの設定は、細胞内記録の設定と比較して、細胞外応答のモニタリングとはわずかに異なります。付随する記事に指定された装置を用いて、浅指屈筋を支配する3番目の神経経路を吸引電極内に吸引します。

これで活動電位の記録を開始できます。この経路には5つの興奮性運動ニューロンと1つの抑制性運動ニューロンが存在します。基線活動を記録した後、ブラシで角皮を刺激し、生成される活動電位の変化を観察してください。

次に、前回の実験と同様に、バス溶液をセロトニンなどの神経調節物質に置換し、反応の変化を記録します。追加の演習は付随するテキストに記載されています。この記録は、ブラシで角質を刺激する前と刺激中の第3経路から記録された活動電位を示しています。刺激前の活動電位の頻度と、刺激中の頻度を比較してください。

この記録は、正常生理食塩水およびセロトニン溶液中での第3ルートから記録された活動電位を示しています。正常生理食塩水中の活動電位の頻度と、先ほど示したセロトニン中の頻度を比較してください。刺激（ブラッシング）により、ベースラインよりも発火頻度が増加します。

また、セロトニンによって、生理食塩水の場合よりも発火頻度が増加することも示されました。この図は、ブラッシングとセロトニンを併用すると、発火頻度がさらに大きく増加することを示しています。外部カリウム濃度が静止膜電位に及ぼす影響について、外部から得られた結果と理論的な導出結果を比較することで、イオンが膜電位に与える影響が明らかになります。

また、速筋および遅筋の両方の神経筋接合部におけるニコチン性反応の記録方法についても説明しました。これらの手法は、生理学の基礎概念を教えるための学生向け研究実習に利用できます。この実験演習で習得した技術は、他の実験準備に関連する疑問への回答や、医学および健康に関連する生理学的応用に使用することが可能です。