ザリガニ後腸との生理学的実験：学生実験室実習

本レポートの総合的な目的は、生理学の実験に参加する高校上級生および学部生の生理学コースにおける教育ツールとなることです。学生は、ザリガニの後腸を露出させ、その収縮を記録する方法を学びます。さらに、動物から後腸を摘出する手順を習得することで、化合物の直接投与が可能になります。

次に、後腸平滑筋収縮の強度とリズムをモニタリングしながら、さまざまな薬理学的薬剤を投与し、収縮強度を変化させるメカニズムを検討します。薬理学的アッセイおよび受容体サブタイピングに基づき、モジュレーターが神経内層に作用しているか、あるいは筋肉に直接作用しているかを示す結果が得られます。こんにちは、ブロック大学生物科学科のJ. Mercier博士です。

私は、内臓筋を制御する神経伝達物質の研究を行うための準備として、ザリガニの後腸を用いてきました。また、この準備を教育ツールとしても活用しており、ケンタッキー大学のRobin Cooper博士の研究室との共同研究の一環として、教育目的で学生が実施できる多くの実験を完成させています。この手法により、ザリガニの後腸の機能に関する洞察を得ることができます。

また、蠕動リズムに関与する疾患などの病態研究にも適用可能です。さらに、筋肉および神経支配の調節を支えるメカニズムの解明にも利用できます。学生は、薬理学的薬剤、神経伝達物質、および神経ホルモンを用いることで、生理学的および薬理学的データの解釈方法を学び、受容体機能に関する一般的な理解を深めます。

アゴニストおよびアンタゴニストに関して、学生は用量反応曲線を構築し、統計分析のためにデータをグラフ形式で提示します。動物を麻酔させるには、体長6～10 cmのザリガニを氷上に5～10分間置きます。麻酔状態のザリガニを、片手でハサミの後ろ側から保持します。眼窩から頭部中央にかけて両側を素早く切り、その後、ザリガニを斬首します。

調製した血液は乾燥すると粘着質になるため、完了後は器具を洗浄してください。次に、脚と爪を切り落とします。続いて、左右の尾鰭を切り取り、中央の尾鰭は残します。腹部の背面側から最後の節に達するまで切り進めてください。

次に、最後の節に沿って切り、反対側を下方向に切ります。背甲を取り除きます。解剖したザリガニを、ろ紙を敷いたペトリ皿に入れます。

ザリガニの生理食塩水。準備のために、解剖ピンを使用して試料をペトリ皿に固定します。後腸は通常、血管と結合組織の塊に囲まれています。

これらをピンセットで除去します。この際、腸を傷つけないように注意してください。これで腹部に沿って後腸が見えます。

解剖したザリガニの標本を生理食塩水に約10分間浸し、解剖および生理食塩水への曝露によるショックから回復させます。後腸の緩やかな蠕動運動を確認してください。これで、収縮率の算出を開始できます。

30秒間に発生する収縮回数をカウントし、ログに記録します。また、発生した収縮の種類、およびそれが蠕動性か痙攣性であるかを記録してください。蠕動波がある場合は、その方向を書き留めてください。

肛門付近と腹部の中央における収縮速度を計測し、これら2つの領域間で速度に差があるかを確認します。さまざまな試験溶液を準備し、浸漬用生理食塩水と同じ温度にしておきます。ここで最初に試験する溶液は、ザリガニ生理食塩水で調製した1 µMのセロトニンです。

ピペットを使用して、露出したザリガニの腹部の腔内から生理食塩水を抜き取り、1 µM セロトニン溶液を後腸に直接滴下します。新しい溶液を添加した直後、30秒間待ち、その後、肛門付近の領域で30秒間に起こる収縮回数を数え、続いて腹部の中間点において次の30秒間の収縮回数を数えます。これらの数値をチャートに記録し、同時に発生した収縮のタイプもメモしてください。次へ。

記録皿から試験溶液を捨て、後腸を通常のザリガニ生理食塩水で数回洗浄します。その後、5分間、30秒ごとに調製物を洗浄してください。この時点で、次の試験溶液（このデモンストレーションでは1 µMのTopamine）を添加できます。

前述と同様に観察結果を記録し、残りの試験化合物についてもこの工程を繰り返します。同一物質を複数の濃度で使用する場合は、必ず低濃度から始めて、徐々に濃度を上げてください。消化管（GI）収縮力を測定するためのセットアップには、LabChart 7ソフトウェアをインストールしたノートパソコン、ブリッジポッド、PowerLab 26T、および力変換器（フォーストランスデューサー）が含まれます。

消化管筋の収縮力を測定する前に、消化管を単離する必要があります。そのためには、最後腹節の筋肉を切り除き、肛門の両側にある柔らかい腹側クチクラに2本以上のピンを刺した後、後腸と肛門を少量のクチクラに付着させた状態で残し、腹部の残りを切り除きます。腸は、胸部と腹部の接合部の近くで切断してください。

次に、消化管を底面にサルコートを塗布した浅いディッシュに移します。消化管の背側に沿って走行する血管があります。これを慎重に消化管から引き離してください。

新鮮なザリガニ生理食塩水を標本に注ぎます。フォーストランスデューサを標本の上に移動させます。フォーストランスデューサの底面に接着されているピンを注意深く確認してください。

腸に固定する端には小さな曲がりがあります。ピンのこの小さな曲がり部分を後腸の切断端に引っ掛けます。後腸を引っ掛けた後、後腸がピンと張るまでディッシュをわずかに移動させます。

腸をピンと張らせる必要がありますが、強く張りすぎないよう注意してください。強く張りすぎると筋肉を損傷させる可能性があります。ディッシュが最適な位置に配置されたら、ワックスまたは粘土を使用してディッシュを固定します。

次に、ソフトウェアを起動します。記録を開始するには、LabChartソフトウェアを開いてください。LabChartのウェルカムセンターを閉じます。

左上の「setup」に移動します。左下の「channel settings」をクリックしてください。チャンネル設定を変更し、チャンネル数を1つだけにします。

画面右側の「OK」をクリックします。チャンネル1のオープンブリッジポッドに移動します。チャート右上にあるレンジ設定を、最も感度の高い設定（この場合は200 µV）に設定します。

1秒あたりのサイクル数を2Kに設定します。これで記録の準備が整いました。「開始」をクリックし、セットアップが正しく機能していることを確認してください。

ピペットでトランスデューサーの先端に軽く触れます。ソフトウェアで記録される力に変化が見られるはずです。ソフトウェアのストップをクリックし、次にスタートをクリックしてプログラムを実行させます。

約20秒間経過後、「ストップ」をクリックし、「saline」というラベルのコメントを追加します。収縮回数は、ある偏向の開始から次の偏向の開始までの時間を測定するか、1〜2分間の総偏向数を数えることで算出してください。収縮の速度に応じて、1分間あたりの収縮回数、または1秒間あたりの収縮回数として算出します。

収縮力を測定するには、保存されたファイル上の異なる条件下での収縮を比較するために、相対的な測定値を使用します。マーカーMをベースラインに移動させ、次にカーソルを偏向のピークに移動して、画面右上に表示される値を記録します。これはMからピークまでの差を示すデルタ値です。

変化を測定するためには、カーソルをピーク位置に静止させておく必要があることに注意してください。次に、Mマーカーとカーソルを目的の次の波形に移動し、測定を繰り返してモジュレーターの影響を調べます。この調製状態で、生理食塩水をテスト溶液にゆっくりと切り替えます。

このケースでは、1 µMのセロトニンを用い、最後のテストとして収縮の頻度と強度を記録し続けます。この標本を用いて、ギャップ junction 阻害剤が収縮の頻度または強度を変化させるかどうかを検証します。ギャップ junction 阻害剤には、1-ヘプタノールまたは二酸化炭素をバブリングした生理食塩水が含まれます。これらの化合物は、長時間さらされると筋線維を損傷させる可能性があるため、最後に使用します。各種化合物の効果を比較するために、データをチャートにグラフ化してください。

この標本のもう一つの興味深い用途は、環状筋によって発生する力を記録することです。ただし、標本にギャップ結合阻害剤を適用した場合、阻害剤が環状筋を損傷させた可能性があるため、その場合は新鮮な後腸標本を用いて環状筋の試験を行う必要があります。環状筋を露出させるには、微細剪刀を用いて腸管を縦方向に切開してください。

細いピンを用いて、組織の一端をディッシュにしっかりと固定します。もう一端をトランスデューサーのフック付きピンに取り付けます。縦走筋でテストしたときと同じ化合物を本標本に添加します。テストした化合物と、収縮の回数および種類との関係をここに示します。

生理食塩水、セロトニン、およびグルタム酸溶液について、収縮回数と時間の関係をグラフ化できます。また、生理食塩水、セロトニン、グルタム酸溶液について、収縮回数と収縮力（mV）の関係をグラフ化することも可能です。これらのグラフを縦走筋と環状筋の両方で作成することで、腸の異なる領域における縦走筋と環状筋が、さまざまな調節因子に対して異なる反応を示すかどうかを検証できます。

上記の実験は、肛門から腹部に向かって異なる領域で繰り返すことができます。この手順を行う際は、ピンセットで胃腸管を傷つけないよう注意し、フォーストランスデューサーで強く引っ張りすぎないことが重要です。この手順に続き、筋肉の電気生理学的記録などの他の手法を用いることで、イオンチャネルの機能や調節といった他の課題に取り組むことができ、また他の動物モデルにおける他の組織のモデルとしても活用できます。