ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

この手順の全体的な目的は、適切な製品を使用することでウェスタンブロットを容易に実施できることを実証することです。サンプルの調製後、タンパク質をサイズに基づいて分離し、固相に転写します。その後、抗体を用いてタンパク質をプローブし、検出します。適切なプロトコルと高品質でコストパフォーマンスの高い試薬を使用することで、ウェスタンブロッティングの結果を向上させることができます。

こんにちは。私はカリフォルニア州サンディエゴにあるEMD Chemicalsの研究開発科学者、ジェシー・ルーハンです。EMDは、ドイツのダルムシュタットにあるMerck KGaAの関連会社です。本日は、ウェスタンブロッティングの手法についてご紹介します。

それでは始めていきましょう。ウェスタンブロッティングの最初のステップはサンプルの調製です。まず、2,500 ×gで5分間などの低速遠心分離を行い、細胞をペレット化してサンプル調製を開始します。

遠心分離後、細胞ペレットをデカントします。10⁶個の細胞あたり150 µLのCytoBusterタンパク質抽出試薬を用いて、細胞を十分に再懸濁します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。

次に、遠心分離後、サンプルを4°Cで16,000 ×g、5分間遠心分離します。上清のSNAを新しいチューブに移し、解析に進みます。サンプルのタンパク質濃度を測定した後、タンパク質を変性させるため、ゲルのロード用サンプルを調製します。

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などのイオン性変性剤を含むサンプルバッファーを使用します。混合物を95から100°Cで5分間加熱してください。市販のプレキャストゲルを使用することで、タンパク質を分子量に基づいて迅速に分離できます。

電気泳動装置に、Omni PUケミカルラインで提供されている試薬から調製可能な走行緩衝液を満たします。ウェルの最初のレーンにトレイルミックス蛋白質マーカーをロードします。このマーカーには3本の参照バンドがあり、電気泳動中のモニタリングが可能です。

ゲルを染色すると、10 kDaから225 kDaの範囲に10本のバンドが確認できます。変性させた試料を、残りのウェルにロードします。ゲルを220 Vで1時間電気泳動させます。

タンパク質の分離後、Rapid StainおよびUltrasensitive Stain（DS不要の既製品）を用いてゲルをクマシーブルーで染色し、タンパク質が均一に移行していることを確認します。電荷を持つタンパク質が電場によってゲル内を移動するように、電場を用いてタンパク質をゲルからNITROCELLULOSEまたはPVDFなどのメンブレンに転写するため、染色が必要となります。PVDFメンブレンを使用する場合は、メンブレンをメタノールに数分間浸した後、氷冷した転写バッファーで5分間平衡化させます。また、ゲルも氷冷した転写バッファーに数分間浸してください。この平衡化により、転写中のゲルの収縮を防ぐことができます。

ウェット転写を行うには、スポンジとペーパーの間にゲルとメンブレンを挟んでサンドイッチ状に組み立てます。次に、ゲルとメンブレンの間に気泡が入っていないことを確認し、アセンブリをしっかりとクランプで固定します。このサンドイッチを転写バッファーに浸し、電場を印加してください。

負に帯電したタンパク質は正電極に向かって移動します。その後、メンブレンがタンパク質を停止させ、結合させることで、それ以上の移動を防ぎます。転写が完了したら、タンパク質を可視化し、気泡がなく均一に転写されているかを確認してください。

これはred alert Western blot stainを用いて簡単に行うことができます。この染色はそのまま使用可能であり、水で容易に脱染色ができます。これは、抗体でプローブ処理する前に水で洗浄して脱染色した後のゲルです。その後、メンブレンをブロッキングします。

非特異的な結合を防ぐため、高品質なブロッキング剤を用いてメンブレンをブロッキングします。バックグラウンドの上昇を避けるため、ブロッキング溶液中で室温にて1時間、緩やかに攪拌しながらインキュベートし、その後メンブレンをTBSTまたはPBSTで3回洗浄します。これらのバッファーは、それぞれTBS tweenタブレットおよびPBS tweenタブレットを用いて簡単かつ便利に調製できます。

メンブレンのブロッキングと洗浄が完了したら、一次抗体でインキュベートします。シグナルを大幅に増強させるSignal Boost溶液を用いて、一次抗体を適用します。溶液1で一次抗体を調製し、メンブレンを1時間インキュベートしてください。

インキュベーション後にブロッキング剤を追加する必要はありません。メンブレンをTBSTで洗浄します。次に、signal boostの溶液2で希釈した二次抗体を用いて、メンブレンを1時間インキュベートします。

最後に、HRP結合二次抗体の検出のために、メンブレンをTBSTで数回洗浄します。ここでは通常、化学発光増強法（ECL）による二次抗体の検出が行われます。ルミノールやエンハンサーの混合が不要なECL試薬のラピッドステップ（rapid step）を使用します。

メンブレンに数回スプレーし、2分間インキュベートした後、X線フィルムを用いて現像します。Rapid Stepは、低ピコグラムレベルの感度を提供し、基質の添加後最大2時間にわたって発色が持続します。Trail mixプロテインマーカーを使用することで、標準的なWestern blotプロトコルと比較して、電気泳動中のタンパク質の追跡が可能になります。

Signal Boostを使用することで、ダイナミックレンジと感度を向上させることができます。最後に、従来のECL試薬の代わりにRapidステップを使用することで、より優れた感度を得ることが可能です。以上で、包括的な製品ラインナップを用いて、効率的かつコストパフォーマンス高くウェスタンブロッティングを行う方法を説明しました。

結果の質は、使用する試薬の質に依存することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。