イムノブロット解析

イムノブロッティング（一般にウェスタンブロッティングと呼ばれる）は、タンパク質試料の中から、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に認識される特定の抗原を同定するために用いられます。この手順は通常、1次元または2次元ゲル電気泳動の後に行われ、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写します。その後、これらの膜を、酵素が直接または間接的に結合した一次抗体および二次抗体でインキュベートし、発色基質または蛍光基質の反応を用いて、膜上のタンパク質抗原を可視化します。

このビデオでは、免疫ブロッティング手順のステップバイステップのデモンストレーションを提供します。こんにちは、私はUVPIのSean Gallagherです。KE Graduate Instituteのプロテオミクスセンターと共同研究を行っています。今日は、免疫ブロッティング解析について説明します。

この手法には、タンパク質の分離、膜への転写、免疫プローブ、および発色基質や化学発光基質を用いた可視化などの多くの工程が含まれます。それでは始めていきましょう。免疫ブロッティングの手順を開始する前に、まず小型または標準サイズの1次元または2次元ゲルを用いた電気泳動によって、タンパク質サンプルを分離させる必要があります。

抗原サンプルを調製し、ゲルの各レーンにロードします。その際、1つ以上のレーンに、あらかじめ染色済みまたはビオチン化されたタンパク質である分子量マーカーを含めてください。これらのタンパク質マーカーはメンブレンに転写され、免疫染色後のメンブレンの向きやタンパク質のサイズを容易に確認するための指標となります。電気泳電が完了したら、イムノブロットを組み立てる準備が整います。

イムノブロットを組み立てるために、まずゲルサンドイッチを分解し、スタッキングゲルを除去します。その後、転写バッファー中で室温で30分間ゲルを平衡化させます。この平衡化は、転写中にゲルのサイズが変化することを防ぐために必要です。ゲルを平衡化させている間に、プラスチック製転写カセットが入る十分な大きさのトレイに転写バッファーを満たし、カセットが浸かるようにして、転写サンドイッチの組み立てを開始します。次に、プラスチック製転写カセットの下半分に、スコッチブライトパッドまたはスポンジを配置します。

次に、ゲルと同じサイズにカットしたフィルターペーパーを用意します。これを転写バッファーで十分に濡らしてから、スコッチブライトパッドの上に置きます。30分間のゲルの平衡化が完了したら、フィルターペーパーの上にゲルを配置します。

テストチューブやガラス棒をゲルの表面上で優しく転がし、ゲルとフィルターペーパーの間の気泡を取り除きます。または、BioRadキットに付属しているBioRadローラーを使用してもかまいません。フィルターペーパー、ゲル、メンブレンを操作する際は、必ず手袋を着用してください。

手の油脂が付着すると転写が妨げられます。次に、転写用メンブレンを準備します。ゲルのサイズに、各辺1〜2 mmの余裕を持たせてメンブレンをカットしてください。

次に、メンブレンの一端を45度の角度にして、ゆっくりと蒸留水に入れます。すると、水がメンブレンに吸い上げられ、最終的に表面全体が濡れます。水に浸す速度が速すぎると、空気が入り込み、メンブレン上に白い斑点として現れます。これらの領域にはタンパク質が転写されません。

メンブレンが完全に濡れたら、転写バッファーで10〜15分間平衡化します。この濡らしの手順は、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンに適用可能です。PVDFメンブレンのみ疎水性であるため、蒸留水や転写バッファーに浸すだけでは濡れません。

PVDF膜をまず100% methanolに1〜2秒間浸し、その後、転写バッファーで10〜15分間平衡化させます。いかなる時点においても、膜を乾燥させないでください。

これをメタノールで再度湿らせ、続いて転写バッファーで湿らせます。メンブレンの準備ができたら、あらかじめ湿らせたメンブレンをゲルの上面に直接置きます。試験管のガラス棒またはBioRadローラーをメンブレンの表面上で軽く転がし、ゲルとメンブレンの間の気泡をすべて取り除くようにしてください。

次に、別のWhatman 3 mmフィルターペーパーを濡らします。それをメンブレンの上に置き、再びすべての気泡を取り除きます。その後、このフィルターペーパーの上に別のスコッチブライトパッドまたはスポンジを置きます。

トランスファーカセットの上半分を固定し、イムノブロットサンドイッチの組み立てを完了させます。イムノブロットサンドイッチが組み上がったので、ゲルからメンブレンへタンパク質を転写する準備が整いました。転写の手順を開始するために、エレクトロブロッティングタンクに転写バッファーを満たし、サンドイッチを封入したトランスファーカセットをエレクトロブロッティング装置にセットします。

メンブレンがアノードまたはタンクの正極側に面するようにサンドイッチを作ることが重要です。電源のリード線を、エレクトロブロッティング装置の対応するアノード側とカソード側に接続します。この特定の基準ブロッターには、冷却用アイスブロックが付属しています。

次に、タンパク質をゲルからメンブレンへ電気泳動転写します。冷却しながら50 Vで30〜60分間、または冷室にて14 Vで一晩転写します。転写が完了したら、電源を切り、装置を分解します。その後、ブロッティング装置からメンブレンを取り出し、角をカットして向きを記録しておきます。

この時点で、メンブレンを乾燥させ、再封可能なプラスチック袋に入れて4 °Cで1年間保存することができます。次工程に進む前に、乾燥したPVDFメンブレンを少量の100% methanolに入れ、メンブレンを濡らす必要があります。その後、蒸留水に入れてmethanolを除去します。

向きをマークした後、ゲルを染色して転写効率を確認します。転写されたタンパク質を可視化するには、Cipro Rubyを用いて可逆的に染色するか、Kamasi Blue India ink、ナフトールブルー、またはコロイド金を用いて不可逆的に染色します。これらの不可逆的な染色手順は、ナイロン膜には適用できません。

タンパク質がメンブレンに転写されたので、免疫プローブ法によるタンパク質の検出と可視化を行います。このステップでは、メンブレン上に固定化されたタンパク質を特異的抗体でプローブし、存在する抗原の同定および定量を行います。まず、メンブレンを20 millilitersのブロッキングバッファーを入れたプラスチック製インキュベーショントレイに配置します。

バッグを使用する場合もありますが、異なる一次抗体溶液で大量のストリップを処理する際には特に有用であるため、トレイが頻繁に使用されます。次に、密閉したメンブレンを室温で30〜60分間、オービタルシェーカーまたはロッキングプラットフォームを用いて撹拌しながらインキュベートします。メンブレンのインキュベーション中に、一次抗体とブロッキングバッファーを希釈します。

希釈倍率は経験的に決定しますが、通常は1/100から1/1000の間です。ポリクローナル抗体の場合、ハイブリドーマの上清では1/10から1/100、モノクローナル抗体を含むマウス腹水では1/1000超となります。インキュベーションが完了したら、ブロッキングバッファーを捨ててください。

バッファーを希釈した一次抗体に置き換え、再び室温で30〜60分間、絶えず撹拌しながらインキュベートします。次に、100 mLのTTBS（ニトロセルロースまたはPVDFフィルターの場合）またはTBS（ナイロンフィルターの場合）を用いて、メンブレンを4回撹拌して洗浄します。

メンブレンの洗浄中は、毎回10〜15分間洗浄し、二次抗体をブロッキングバッファーで希釈します。二次抗体の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、抗IGコンジュゲート、市販の酵素標識抗体などが挙げられます。二次抗体は通常、使用前に1:200から1:25,000まで希釈します。

洗浄ステップが完了し、洗浄液を廃棄した後、希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ抗Ig抱合体を加え、室温で絶えず攪拌しながら30〜60分間インキュベートします。30〜60分後、ビンからメンブレンを取り出し、前述のTTBSを用いて、1回10〜15分間、計4回洗浄します。

洗浄が完了したら、可視化の手順に進みます。ただし、その前に代替的な免疫プロービング法について説明します。この代替的な免疫プロービング法は、Vector Labs社のVector Stain ABCキットに基づいたものです。

この手法では、アビジン-ビオチン複合体を用いて、ビオチン化二次抗体にホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）またはアルカリホスファターゼ（AP）を結合させます。本日は、HRPキットを用いて実演します。TTBSは、アビジン-ビオチンシステムにおいてブロッキングバッファーとして適しています。

一方、ナイロンフィルターについては、脱脂粉乳に残留ビオチンが含まれており、これがイムノアッセイを妨害するため、タンパク質結合試薬の使用が推奨されます。脱脂粉乳はブロッキングステップでのみ使用し、オービタルシェーカーまたはロッキングプラットフォームを用いて、オープンなトレイ内で膜を絶えず攪拌しながらブロッキングバッファーで平衡化させます。膜を室温で30分から60分間インキュベートし、平衡化させます。

一次抗体溶液を調製します。高感度 Aden. Biotin システムを用いた NITROCELLULOSE または PVDF 膜を使用する場合は、TTBS を使用してください。

一次抗体を含むセラの希釈倍率は、通常1,000倍から100,000倍の範囲です。化学発光法を用いる場合は、より高い希釈倍率が必要となります。本手順では、発色法を用いて実演します。

一次抗体は5,000倍に希釈して使用します。平衡化が完了したら、ブロッキングバッファーを除去します。次に、メンブレン全体を覆うのに十分な量の一次抗体溶液を加えてください。

メンブレンを室温で、緩やかにロッキングしながら30分間インキュベートします。その後、ニトロセルロースの場合はTTBSで5分間隔で3回洗浄します。洗浄ステップの間、ビオチン化抗体を1滴、10 millilitersのTTBSで希釈して、ビオチン化二次抗体溶液を調製します。洗浄ステップが完了したら、二次抗体溶液を加えます。

二次抗体でインキュベートしている間、メンブレンを室温で30分間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。そのために avadon biotin HRPO を調製します。vti stain reagent A を2滴と reagent B を2滴、10 milliliter に混ぜ合わせます。

ニトロセルロース膜をTTBSで処理します。二次抗体のインキュベーションが完了した後、室温で30分間インキュベートします。その後、TTBSまたはTBSを用いて、15分間で3回膜を洗浄します。

次に、アビジン・ビオチン酵素溶液をメンブレンに加え、室温で30分間、緩慢に揺らしながらインキュベートします。その後、TTBSを用いて10分間隔でメンブレンを3回洗浄します。これで免疫プローブの手順が完了し、メンブレン結合タンパク質を発色基質で可視化できる状態になります。

この最終的な可視化ステップでは、基質である4,3-Diaminobenzidine (DAB)/ICL IIおよびTMBが、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）ベースの免疫検出手順で一般的に使用されます。免疫プローブの手順における最終的なメンブレン洗浄をTTBSで行った場合は、室温で50 mLのTBSを用いてメンブレンを15分間洗浄してください。その後、メンブレンを発色可視化溶液に浸します。

タンパク質のバンドは10～30分で現れます。30分間のインキュベーション後、基質反応混合液を廃棄し、蒸留水を加えて反応を停止させます。イムノブロッティングは、1次元または2次元電気泳動後に特定のタンパク質の存在を検出するために、数千の研究室で使用されている多段階の手順です。

以上で、免疫血液分析の実施方法について解説しました。これで完了です。皆様の実験が成功することを願っております。ご視聴ありがとうございました。