腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス

本手順の目的は、in vitroで腫瘍微小環境を再現し、化学療法剤の試験に使用可能なマイクロ流体デバイスの作製と動作を実証することです。こちらがそのマイクロ流体デバイスです。このデバイスは、in vitroでの化学療法剤の簡便な試験などの分野で有用です。

本装置は、3次元腫瘍組織の試験において一貫性と精度の高い結果を提供し、生体内腫瘍を非常に正確に再現します。腫瘍は3次元微小環境に存在するため、そのような環境で試験を行える能力は極めて重要です。手順の最初のステップは装置の組み立てであり、これにはソフトリソグラフィを用いたマイクロ流体チップの作製、入口と出口への穴あけ、ガラススライドへの接合、および流体入口と出口のためのチューブの接続が含まれます。

次に、ハンギングドロップ法を用いて、デバイスで使用するための均一な多細胞腫瘍スフェロイドを作製します。その後、スフェロイドをデバイスに導入し、続いてアポトーシス検出剤および化学療法剤を添加します。最後に、タイムラプス顕微鏡観察を行い、化学療法剤の浸透能を定量化するために薬剤拡散係数の数学的推定を行います。

最終的に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いることで、デバイス内での組織成長、組織内における不均一な微小環境の形成、および組織への薬剤拡散を示す結果を得ることができます。固形がんへの抗がん剤の浸透が制限されることは、治療失敗の重要な原因となっています。現在の多くの抗がん剤試験モデルは、固形がんの三次元的な性質を模倣できていません。

我々は、持続的に灌流される三次元腫瘍組織で構成されるマイクロ流体デバイスを開発しました。このモデルは、固形腫瘍への薬剤送達および全身性のクリアランスをより正確に再現します。多細胞腫瘍スフェロイドは、三次元腫瘍組織の確立されたモデルです。

本手順では、マイクロ流体デバイスで使用するスフェロイドを作製するために、ハンギングドロップ法を用います。この方法により、短期間で均一なスフェロイドを形成させることが可能です。3次元組織を用いて化学療法剤をin vitroで試験することは、細胞単層での試験と比較して、より効率的な薬剤スクリーニングに寄与します。

シリコンエラストマーのPDMSと硬化剤を重量比9:1で混合します。次に、この混合液をマスターの上に注ぎ、厚さ4 mmの層を形成して脱気します。気泡を除去するため、60 °Cで5時間硬化させます。

硬化したPDMSをモールドから剥がし、エラストマー上に流路構造を持つスタンプを作成します。次に、ドリルに取り付けた1.5 mmの生検パンチを使用し、入口と出口となるパンチ穴を開けます。破片などはすべて取り除いてください。

スタンプの機能面と洗浄済みのガラススライドを、酸素プラズマに8分間さらします。酸素プラズマエッチャー内で、処理した表面同士を直ちに接触させ、接合させます。このアセンブリをスライドウォーマーを用いて60 °Cで少なくとも5時間保持します。

接合部を強化するため、内径0.032 inchesのPTFEチューブをマイクロ流体デバイスの入口および出口に接続します。オス用ルアーロックコネクタをバーブ付きメス用ルアーロックコネクタに取り付けたインターフェースを使用することで、破損させることなく容易にチューブを通すことができます。最後に、遮断弁とY字コネクタを用いて流路アセンブリを構築し、デバイスを顕微鏡に設置します。デバイスの設置後、適切な入口および出口にチューブを接続し、流路セットアップを完了させます。

この図に示すように、この構成により、スフェロイドをデバイスにパッキングする際の簡便性と汎用性が確保されるか、あるいはデバイス内に培地の流れを作ることでパッキングを行うことができます。パッキング入口バルブVPNとパッキング出口バルブVP outを開きます。これにより、腫瘍スフェロイドが入口を通過して培養チャンバーへと流れ込み、チャンバー内のポストが培地を流す際に腫瘍を所定の位置に固定します。

パッキングバルブを閉じ、流入バルブ VF in と流出バルブ VF out を開いて、均一な PHE の形成を開始します。クリーンベンチ内で、吊り滴法を用いてトリプシン処理した細胞を氷上で処理します。遠心分離機から得られたトリプシン処理細胞を回収します。

表1を参照し、ストック溶液を目的の濃度まで希釈します。次に、48ウェルプレートの蓋を取り外し、逆さまに置きます。滅菌フード内で、プレートの各ウェルに滅菌水 1 mL を満たします。

湿度を維持するため、カバー上の各円形領域に希釈細胞溶液を20 µLずつ滴下します。マイクロピペットを使用して、カバーを慎重に反転させてプレートの上に配置し、液滴がウェルの端に触れないようにしてください。その後、プレートを37 °Cでインキュベートします。

使用する特定の細胞に基づいたインキュベーション時間は、表1を参照してください。各ハンギングドロップ内でステロイドが形成されます。まず、フロー入口から70% ethanolを流し、デバイスを滅菌します。続いて、PBS、次いでHEPES緩衝細胞培養培地をそれぞれ流してください。

培地シリンジを準備し、チューブに取り付けます。次に、2～3回分量のステロイドをシリンジに吸い込みます。気泡を除去するため、シリンジをデバイスのパッキング入口に取り付けます。

入口バルブVPNを開き、出口バルブVP outおよびVF outを閉じます。パッキング用シリンジを、針が下を向くように垂直に保持します。ステロイドがシリンジの底、針のルアーロックコネクタ部分に沈殿するまで待ちます。

パッキング用シリンジのプランジャーを押し、PHEがチューブに入りデバイスへと流れるのを確認します。このとき、パッキング出口バルブのみが開いています。ステロイドがデバイスのチャンバーに入り、後方のポストによって保持されます。チャンバー内部に入ると、Sスフェロイドはチャンバーの形状に適合し、長方形の形状になります。

入口バルブVPNと出口バルブVP outを閉じ、シリンジポンプにフローシリンジSFを装着します。このポンプは、Syringe Pump Proを用いてコンピュータで制御します。入口バルブVFNと出口バルブVF outを開きます。3 µL/minの速度でデバイスへの培地の注入を開始します。

スフェロイドを24時間インキュベートした後、アポトーシス検出剤を導入します。アポトーシス検出剤または治療剤を導入する前に、栄養勾配と微小環境を形成させるため、スフェロイドを最大24時間静置して平衡状態にします。その後、バルブVFNを閉じます。

シリンジポンプを停止します。ポンプからシリンジを取り外し、0.25 µL/mLのCASPglow Red active Caspase 3マーカーを含む培地を入れたシリンジに交換します。この溶液0.7 mLを手動でデバイスに流し込み、デバイスを洗浄します。

その後、シリンジをポンプに取り付けます。フローを再開し、バルブVFNを開きます。5〜8時間かけて、cask glove red active cph phase threeが組織に拡散し、アポトーシス領域でより強く蛍光を発します。以降のすべてのフロー溶液において、この濃度のapoptosis detecting agentを維持します。

アポトーシス検出剤を導入した後、5〜8時間後にドキソルビシンを導入します。この処理後は、フラッシングによってシステム内から除去します。化学療法剤を添加するには、アポトーシス検出の手順に従い、10 µMの塩酸ドキソルビシンを導入してください。

次に、処置用シリンジを0.7 millilitersの培地が入ったシリンジに交換します。治療薬の注入を一定時間継続します。その後、バルブVFNを閉じてシリンジポンプの電源を切ります。

シリンジポンプから処置用のシリンジを取り外し、0.7 milliliters の培地が入ったシリンジに交換します。顕微鏡下で組織を継続的に観察しながら、新鮮な培地を 24 から 36 時間流し続けます。タイムラプス顕微鏡による全取得プロセスは、IP lab のカスタムスクリプトを用いて自動化し、PAX Foid の透過光および蛍光画像を 10 x 倍率で 30 分ごとに取得しました。薬物拡散係数の数学的推定における最初のステップは、Image J を用いて薬物の蛍光の平均線形強度プロファイルを生成することです。チャンバー内の組織を包含する長方形の関心領域（ROI）を選択します。

plot profileコマンドを使用して、流路からの距離の関数として平均強度のプロファイルを作成します。これを最大3つの異なるタイムポイントで繰り返します。次に、得られた強度プロファイルから平均背景蛍光強度を差し引き、それぞれのプロファイルを対応する最大強度で正規化して、XおよびTの関数としてのCを求めます。ここでCはドキソルビシンの正規化濃度であり、Cの値は0から1の間で変動します。

次のステップは、腫瘍組織内におけるdoxorubicinの有効拡散係数を評価することです。拡散は、ERFCを相補誤差関数とする次の方程式で表すことができます。Xはチャネルから組織内部への距離を、Tはdoxorubicin導入後の時間を表します。

検討する各タイムポイントにおいて、以下の反復スキームを使用します。Dの値を推定し、各位置における方程式の右辺を算出します。X。両辺の残差平方和を算出し、平均残差を最小化するようにDを修正します。

組織内におけるドキシルビシンの平均有効拡散係数を推定するため、各時点で得られたDの最適値を示します。マイクロ流体デバイスは、3次元腫瘍組織を育成するための、1 mm × 0.3 mm × 0.15 mmの光学的にアクセス可能な培養チャンバーを備えていました。ハンギングドロップ法を用いることで、複数の細胞株からサイズと形状が均一な腫瘍PHEを迅速に形成することが可能となりました。

PHEをデバイス上で最大3日間正常に培養することができました。チャンバー内での成長は、微小環境の再現性のある改変に関連していました。PHE内では、流路に近い細胞よりも、組織のより高い位置および深部にある細胞においてアポトーシスが多く発生しました。

この装置を用いて、ドキシルルビシンおよび腫瘍組織の拡散係数を推定しました。実験的に得られた値は、ヒト乳がんに関して以前に報告された値と一致しました。この手順を行う際は、PHEを装置に流す操作を細胞培養の外で行う必要があるため、無菌状態の維持に細心の注意を払うことが重要です。

滅菌状態を確保するため、フード内のスプレーシリンジとチューブの末端にエタノールを十分に噴霧します。このビデオを視聴することで、腫瘍への薬剤浸透の制限が果たす役割について理解を深めることができます。本ビデオでは、3次元腫瘍組織における薬剤の送達と全身クリアランスを模倣し、その浸透度を定量化する手法を実演しました。

浸透性の低い薬物を排除することで、がん治療薬の開発プロセスを大幅に効率化できるでしょう。