蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

この手順の全般的な目的は、内有毛細胞の求心性シナプスにおけるポストシナプス活動を記録することです。まず、斬首したラットから摘出した直後の蝸牛の感覚上皮を露出させます。次に、切除した蝸牛頂部を модиFIED カバーガラス上に配置し、記録チャンバーへと転送します。

本手順の第3ステップは、記録電極を用いて求心性バトンを特定し、アクセスすることです。最終ステップでは、求心性繊維膜に対して強固なシールを形成させた後に膜を破裂させ、パッチクランプ法のホールセル構成を確立します。最終的に、ホールセルパッチクランプ電気生理学を通じて、単一のリボンシナプスからのポストシナプス事象または電位を示す結果を得ることができます。

蝸牛組織の摘出と作製は習得が困難であり、また微小な求心性繊維の認識およびアプローチも難しいため、本手法を視覚的に提示することは非常に重要です。摘出を開始する前に、記録中に標本を固定するための改造カバーガラスを用意します。直径8〜12 mmの円形ガラスカバーガラスを用い、カバーガラスの端付近に半硬化させたSylgardを1滴塗布します。

細い昆虫ピンの太い方をカバーガラスの上に置きます。昆虫ピンをガラスに強く押し当ててください。ピンセットでシールガードを加熱コイルで熱し、固定させます。

付属のテキストに従って、10〜20本の微小電極を準備します。マイクロフォージで火炎研磨した後、微小電極の外端径は約1 µmである必要があります。3週齢のラットを麻酔して断頭した後、ピペット壁の最終的な厚さは約1/3 µmとなります。

まず、皮膚を取り除き、頭部を解剖して脳を摘出して解剖を開始します。側頭骨を露出させるため、両側の側頭骨を取り除きます。取り出した各側頭骨を、標準的な細胞外液が入った清潔な解剖皿に入れます。次のステップでは、蝸牛を露出させるために、側頭骨を包んでいる骨を除去します。

ピンセットで側頭骨の基部をしっかりと固定します。正円窓、卵円窓、および蝸牛を確認します。卵円窓と蝸牛の螺旋側が上を向くように蝸牛を配置します。

蝸牛周囲の余分な骨を除去します。2本目の精密ピンセットを使用して、骨の他の部分よりも透明度の高い領域から、蝸牛上の骨を直接削り取ります。この領域は骨が薄いため、除去が容易です。

頂端回（apical coil）周囲の骨の除去を続けます。マイクロ解剖用鋏を用いて、頂端回転の下にあるmodisを切断します。その後、頂端回転を蝸牛の下方の回転から切り離します。

頂端コイルを保護するように注意してください。引っ張ったり、伸ばしたりしてはいけません。最後に、組織を過度に引き裂かないように注意しながら、頂端回転部を蝸牛から取り出します。

細いピンセットを使用して、残りの骨を取り除きます。次のステップは、目側条帯（STR of oculis）とtial膜を除去することです。有毛細胞領域の外側に位置する光沢のある組織の帯であるSTR of oculisを慎重に取り除いてください。

感覚有毛細胞を除去しないように注意してください。感覚有毛細胞は、oculisのSTRと共に剥離しやすい性質があります。次に、精細ピンセットを用いてtial膜を剥離します。感覚有毛細胞の上にある光沢のある半透明の膜です。その後、余剰な組織と骨をトリミングし、ピンセットで標本を平らにします。

これは、組織をピンの下に均一に配置するために必要です。これで解剖は完了です。解剖が終わったら、ヘアセルから離れた位置にピンが来るように注意しながら、準備したカバーガラス上のピンの下に標本を配置してください。

ピンセットを使用して、カバーガラス上の蝸牛組織に細胞外液を1滴滴下した状態を維持しながら、調製物を記録チャンバーへ移動させ、直ちに細胞外液による灌流を開始します。調製物の生存率を高めるため、顕微鏡の10倍対物レンズまたは40倍水浸DIC対物レンズを使用してください。調製物の位置を確認するために、記録電極が内耳毛細胞の側壁に対して直角にアプローチできるよう、調製物の向きを調整します。

標本の丸まりにより内有毛細胞の基底部が見えにくい場合は、記録電極を使用して標本の外縁をガラスカバースリップに押し付けてください。その際、内有毛細胞自体を圧迫しないよう注意してください。この操作では、上の電極で標本の外縁を固定し、下の電極で求心性バトン（afferent batons）の位置を示しています。

参照として、NC 70 Nuv Conカメラを用いて拡大画像をモニターに表示し、内有毛細胞領域の組織が健全であるかを確認します。基準点として毛束を見つけ、焦点を合わせて核を探します。さらに焦点を下げ、求心性終末がある内有毛細胞の底部まで移動させた後、モニター上で核のレベルに達するまで焦点を戻します。

次に、内有毛細胞の基部周辺にある求心性バトン（afferent batons）を探します。バトンは球形または楕円形で、直径は約1 µmであり、光沢のある淡い色をしています。ピントを上下に調整することで見つけることができます。

次のステップは、細胞内液を満たした先端径1 µmの記録電極を用いて、求心性線維への経路を確保することです。正圧をかけ、マイクロマニピュレーターを使用して電極を標本まで移動させます。この電極を用いて、内有毛細胞基部のレベルで標本に切開を加えます。

正圧を用いて、支持細胞の薄い層と内耳毛細胞の間に電極を押し込み、内耳毛細胞の基部へのアクセスルートを形成します。電極を慎重に取り除き、細胞内液で満たされた先端径1 µmの新しい電極に交換します。正圧をかけて電極先端の清潔さを維持しながら、記録電極をアクセスホールから隣接する支持細胞を避けながら、求心性バトン（afferent baton）に向けて移動させます。

電極の先端が求心性バトン（afferent baton）の真正前にあることを確認します。バトンは、支持細胞や内有毛細胞膜よりもピペットの移動に対して強い抵抗を示します。この抵抗の差は、ピペットを動かす際に感知することができます。ピペットを上下に動かし、押し当ててバトンが動くことを確認してください。これにより、電極が求心性バトンに押し付けられ、ピペット先端とバトンが同一の焦点面上にあることが示されます。同時に陽圧を解除し、吸引をかけてギガオームシール（giga ohm seal）を形成します。

電極内の膜を破裂させてホールセル記録を得るために、軽く断続的に吸引を適用します。パッチされた細胞が求心性バトンである場合、ホールセル記録モードで小さな容量性過渡応答が観察されます。この図は、求心性線維から記録された典型的な過渡応答を示しています。

シナプス活動の記録を開始します。求心性線維に自発的な活動が見られない場合は、より高濃度のカリウムを含む細胞外液を適用し、有毛細胞を脱分極させます。この図は、左側にAFF線維、右側に内有毛細胞の典型的な電流-電圧関係を示しています。

電流-電圧関係は、保持電位-84 mV、電圧ステップ-124 mVから+36 mVまで10 mV刻みで記録されました。一部のトレースの右側に電圧が示されており、求心性線維からの電流-電圧関係に焦点を当てています。ほとんどの電圧ステップにおいて、興奮性ポストシナプス電流（EPCs）が認められることに留意してください。

EPCは、約+6 mVで正に反転しました。この記録は、電位依存性ナトリウム電流を遮断するためにテトロドトキシン存在下で行われました。遮断剤がない場合、急速に活性化するナトリウム内向き電流がさらに記録に現れ、それが求心性線維の記録であることを示すことになります。また、過分極電位における緩慢に活性化する内向き電流に注目してください。

この電流は内有毛細胞や支持細胞には認められず、記録が求心性線維から得られたものであることを示す良好な指標となります。これらの記録は、内有毛細胞の電流-電圧関係を示しています。矢印は、正の電位における速い活性化を示す外向きカリウム電流を指しています。

続いて、ピペット径が細くアクセス抵抗が高いため、遅延整流カリウム電流が認められます。ここで示している内有毛細胞電流は、内有毛細胞電流を正確に記録するために期待される値よりも小さくなっています。より低いアクセス抵抗を持つピペットを使用すべきです。

しかしながら、ここで提示する記録結果は、内有毛細胞と求心性神経線維の電流-電圧関係を明確に区別できることを示しています。この図は、求心性神経線維から記録されたシナプス電流を示しています。EPCの大きさと形状が多様であることに注目してください。

記録は室温で行われ、電位依存性ナトリウム電流を遮断するためにテトロドトキシンを適用しました。この図は、内有毛細胞とそれに接触している求心性バトンからの同時記録を示しています。電位ステップを用いて内有毛細胞を脱分極させ、その応答として内有毛細胞から内向きカルシウム電流が記録されました。カルシウムの流入は神経伝達物質の放出をもたらし、求心性バトンのEPCを活性化させました。

なお、本手順の実施中に、50ミリ秒の内耳細胞脱分極に伴うシナプス抑制が現れることに注意してください。蝸牛組織の解剖および調製には細心の注意を払い、求心性末端からの記録を試みる際は、忍耐強く前向きに取り組むことが重要です。