メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング

この手順の全体的な目的は、メタゲノムライブラリーからセルラーゼ発現クローンを同定することです。まず、作成済みのメタゲノムライブラリーをロボットを用いて複製し、複製したライブラリーを37°Cで24時間培養します。その後、大腸菌クローンの増殖を測定し、複製ライブラリーに溶解剤、バッファー、および基質を添加します。

最終的に、プレートリーダーを用いた比色吸光度測定により、セルラーゼ活性を示す結果を得ることができます。こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部のSteven Hallam研究室のKeithです。本日は、メタゲノムライブラリーの高スループット機能スクリーニングの手順をご紹介します。

当研究室では、メタゲノムライブラリーからのビオミンセルラーゼ活性を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。このプロトコールを開始する前に、384ウェルプレート形式で保存されたメタゲノムライブラリーを準備してください。

本研究では、ライブラリホストとしてPCC one copy control SMIDベクターとFarge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli細胞を組み合わせて使用しました。この手順を開始するには、-80 °Cで保存されていたライブラリ含有プレートを取り出し、37 °Cで約20分間解凍します。その間に、QIX twoのUVライト滅菌機能を使用して、ロボットを15分間滅菌します。Q fill threeを製造元の指示に従ってセットアップし、滅菌チューブプログラムを介してメディアボトルをマニホールドに取り付けます。

Q fill threeを用いて適切な量の培地を充填し、45 µLの容量で充填するように設定します。各ウェルにおいて、培地が見えるまでロボットのパージ機能を使用してチューブとマニホールドから空気を除去します。マニホールドの各ピンにおいて、Q fill threeを用いて目的の枚数のプレートにLB培地を充填します。

各プレートの充填には約 20 秒かかります。次に、ライブラリプレートと未使用のプレートを Q picks の適切なエリアにロードします。ロボットを使用して、洗浄バスに適切な試薬を満たしてください。

後方のバスに2% micro 90を、中央のバスにオートクレーブ滅菌した蒸留水を、そして前方のバスに80% ethanolを入れます。Qix Twoのレプリケーションプログラムを使用し、適切なヘッド、ならびにソースプレートとデスティネーションプレートの枚数および種類を選択します。また、レプリケーションの間にヘッドを洗浄するように設定します。

通常、各バスで6サイクル行えば十分です。この装置の処理能力は一度に10プレートです。装置を起動してください。

複製には約15分かかります。384ピンヘッドを用いて全容量を転写します。プレートの複製後、湿度ボックス内で37°Cで24時間培養します。

アラビノースの添加によりsmidが高コピー数で誘導されるため、長時間のインキュベーションが必要です。その間に、書面プロトコルに従ってQ fill threeロボットを洗浄してください。インキュベーション後、37 °Cのインキュベーターからプレートを取り出します。

蓋を脇に置き、プレートをRapidStackに付属のマガジンローディングプラットフォームに設置します。ソフトウェアではプレートの順序を管理できないため、必ずプレートの順番を記録しておいてください。スタックの一番下にあるプレートから順に読み取られます。

まず、ラピッドスタックからマガジンを1つ取り出します。マガジンが空であることを確認し、読み取り予定のプレートの山に押し込みます。ハンドルを持ってマガジンを動かすと、プレートがマガジンにロードされます。

マガジンを正しい向きでラピッドスタックにロードします。接続されたコンピュータでスキャン・プログラムを開きます。「new session」を選択し、適切な名前を付けて保存します。

プレートとして、平底384ウェルプレートを選択します。プレートレイアウト領域に入力します。ウィザードボタンを選択し、384個の未知検体をプレートに追加します。

プロトコルエリアでウェルループオプションを選択し、384ウェルと入力します。画面左側のフローツリーにウェルループアイコンが表示されます。そのアイコンを選択し、クリックして光度測定を追加します。

波長を600 nanometersに設定します。プロトコルに固有の名前を付けて保存し、スキャン・プログラムを閉じます。その後、Polara RSプログラムを起動します。

メインページには、rapid stackデバイスに接続された装置の一覧表が表示されています。VARI scanの項目にあるrun sessionオプションをクリックしてください。すると、中央にフローチャートが表示されたアッセイウィンドウが開きます。run sessionアイテムを選択し、保存済みスキャンの名前を探してください。

画面右側に表示されるドロップダウンメニューから「re run」を選択します。プロトコルを選択後、「run」をクリックしてください。すると、ソースとして使用するマガジンと、空のマガジンを指定するダイアログボックスが表示されます。

画面上の下のボックスは、フロントマガジンzineに対応しています。RapidStackとVario scanの両方の電源が入っていることを確認し、Startをクリックします。RapidStackがプレートリーダーにプレートを自動的にロードし、プレートの連続測定が可能になります。

最初のプレートがVario scanにロードされる様子を観察し、機械が正しくアライメントされて読み取りが行われているか確認してください。25枚のプレートの読み取りには約50分かかります。Vario scanが完了したら、満載のマガジンを取り出し、マガジンロードプラットフォームに配置してください。

プラットフォームの外側の長方形を持ち上げると、マガジンが滑り落ち、プレートが中央に積み重なった状態で残ります。最後に、溶液ベースのスクリーニングを行うため、プレートに蓋を戻します。まずセルロース活性を測定するために、あらかじめ調製した10倍濃度の溶解ストックを用いてアッセイミックスを調製します。

記載のプロトコルに従い、pH 5.5の50 millimolar 酢酸カリウム緩衝液を混合します。次に、DMSOを用いて、発色性のDIPHENYLまたはDNP細胞殺生物基質を最大75 milligrams per milliliterの濃度でストック溶液として調製し、基質が完全に溶解していることを確認します。DNP細胞殺生物ストック溶液をアッセイミックスに加え、最終濃度を0.1 milligrams per milliliterにします。

各プレートにつき約20 millilitersの溶液を使用し、デッドボリュームとしてさらに50 millilitersが必要となることに留意してください。前回と同様にQ fill threeをセットアップし、Q fill threeを用いて各プレートにアッセイミックスを分注します。各プレートの充填には約20秒かかります。

アッセイミックスを添加した後、プレートを37 °Cで12〜16時間インキュベートします。加湿ボックス内で、37 °Cのインキュベーターからプレートを取り出します。蓋を外して脇に置き、前回と同様の方法で、RapidStackに付属のマガジンローディングプラットフォームにプレートを設置します。

スキャンプログラムを開き、以前と同様に設定します。ただし、光量測定については400 nanometersで読み取るように設定してください。その後、先に実演した通りに、POLARA RSプログラムにパラメータを入力します。

Vario scanでプレートを読み取ります。測定後、プレートを取り出して廃棄してください。吸光度の測定値をエクスポートするには、scan it re ソフトウェアを開き、選択します。

既存のファイルを開きます。セッションが保存されているディレクトリを選択し、プラスアイコンをクリックしてリストを展開します。「title」の見出しの下に、「container one」から「container N」までのオプションが表示されます。プレートの数に応じて、ページ上部のメニューバーで解析する最初のプレートを選択し、「data report export」を選択してください。

プレートレイアウトや光度データなどのエクスポートオプションを選択します。「view report」をクリックし、次に「file save」をクリックします。保存先のディレクトリを選択してください。

出力形式はMicrosoft Excelのスプレッドシートです。ここでは、ポジティブクローンを含む単一の384ウェルプレートからの吸光度測定値を示しています。ポジティブクローンは、セルラーゼ活性を発現していないクローンと比較して、吸光度が著しく増加していることがわかります。

アッセイ時間、ウェル、プレート上の位置、またはDNP濃度の違いが、絶対吸光度の測定値に影響を及ぼすことがあります。プレート平均またはカラム平均からの吸光度の差などの相対吸光度測定値は、セルラーゼ陽性クローンを特定するためのより堅牢な手法です。以上で、メタゲノムライブラリーからセルラーゼ陽性クローンを特定する方法を説明しました。

この手順を行う際は、DNP cell bio sideをDMSOに溶解させることと、プレートを加湿チャンバー内でインキュベートすることを忘れないようにしてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りします。