ダニのRNA干渉

この手順の全体的な目的は、注射によるマダニのRNA干渉技術を実証することです。まず、標的となる遺伝子の二本鎖RNAを合成します。その後、そのRNAをマダニに注射し、マダニを保湿チャンバー内で24時間保持します。

この保持期間の後、マダニを羊などの動物に吸血させます。体重、脱皮および卵の位置などの吸血パラメータ、ならびにリアルタイム R-T-P-C-R による標的遺伝子または目的遺伝子の発現を測定します。最終的に、マダニの生物学的パラメータの評価およびリアルタイム R-T-P-C-R による遺伝子発現の解析を通じて、標的遺伝子のサイレンシングがマダニの生物学に及ぼす影響を示す結果を得ることができます。

私たちの研究グループでは、ダニと病原体の接点における分子事象の解明に取り組んでおり、この基礎的な情報を利用して、ダニの寄生およびヒトや動物への病原体伝播を制御する方法の開発を目指しています。RNA干渉は、ダニの遺伝子操作が可能な唯一の手法であるため、この研究において不可欠なツールとなっています。多くのダニ遺伝子の機能はまだ解明されていません。

RNA干渉を用いることで、交尾、生殖、吸血、消化、唾液腺機能、および病原体伝播におけるダニのベクター能力など、ダニの生物学的側面の多くにおけるダニ遺伝子の役割や遺伝子発現を定義することが可能になります。本手順のデモンストレーションは、当研究室のダニRNA干渉チームであるEd Lewin博士、大学院生、Busby、および私が行います。二本鎖RNAを生成するには、まずRNAのin vitro転写のためのT7プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成します。

例えば、derma center vari lesinを用います。ここに示すオリゴヌクレオチドプライマーD eight A a T 75およびD eight DVT 73を使用してください。各オリゴヌクレオチドプライマー10 picomolesとダニのtotal RNA 1～10 nanogramsを用い、RT-PCRにより標的遺伝子を増幅させます。

次に、PCR産物を精製します。その後、8 µLまたは約100 ngを用いて二本鎖RNAを合成します。注射に使用するマダニの準備として、まずマダニを以下の溶液で順次洗浄します：水道水、3%過酸化水素水、蒸留水（2回）、70%エタノール、そして最後に蒸留水で2回洗浄します。

50 milliliterの使い捨て遠心チューブに入れ、振とうすることで各洗浄を行う。その後、溶液を細かいメッシュのワイヤースクリーンでろ過して除去する。ペーパータオルでダニの水分を吸い取り、実験内容に応じてダニを20から50匹ずつのグループに分注する。

各グループを密閉蓋付きの1.25オンスのプラスチックカップに入れ、それぞれのカップに実験グループ名を記入します。次に、注射操作を行う3名で構成されるRNAiチームを編成します。1人目の担当者が、3×6インチの赤い歯科用ワックスシートに貼り付けた強力両面テープの上に、各マダニを配置します。

2人目の担当者がダニに注射を行い、3人目の担当者が注射後のダニをモニターします。次に、ダニに二酸化炭素を吹きかけて活性化させ、生存しているダニを数え、実験群番号が記載されたカップに移動させます。チームメンバー全員が使い捨て手袋を着用する必要があります。ダニへの注射工程を開始するには、デュモン微細ピンセットを用いてダニを捕獲し、赤色の歯科用ワックスのシートに貼り付けた強力両面テープの上に、腹側を上にして固定します。ダニを5匹ずつグループにして密接に配置してください。5匹すべてのダニの口器の上に、マスキングテープの小さな断片を貼ります。

さらに固定するため、注入者が注入プロセスを確認できるよう、体の大部分を露出させたままにします。ダニに注入するために、29ゲージの0.5インチ針を装着したインスリン用単回投与シリンジを用いて、外骨格の腹面右下領域に穴を開けます。次に、カスタムメイドのハミルトンシリンジと、45度の刃先を持つ33ゲージの1インチ針を用いて、0.2～0.5 µLの二本鎖RNA溶液を直ちにダニに注入します。二本鎖RNAが確実に配置され、保持されるように、針をダニの体腔の深くまで挿入してください。

注入後に液体が放出されますが、針を深く挿入して注入することで、遺伝子サイレンシングを引き起こすのに十分な量の二本鎖RNAがダニの体腔内に蓄積されます。なお、過剰に注入すると血リンパの喪失を招き、ダニが死に至るため、注意が必要です。ダニに注入した後、直ちに微細ピンセットで両面テープから剥がし、プラスチック製のリカバリー容器に移してください。

注入後、マダニは一時的に不活性状態になりますが、すぐにディッシュ内を這い回り始めます。二酸化炭素を吹きかけてマダニを活性化させてください。マダニが活発に動き出せば、注入部位の傷は速やかに治癒し、生存する可能性が高くなります。

各実験群のダニの数を数え、密閉蓋付きのラベル付きプラスチックカップに各群を入れます。次の実験群に注入する前に、現在の群で死亡したダニを補充してください。ハミルトンシリンジに新鮮な3% hydrogen peroxideを満たして排出させ、次の実験群に注入する前にシリンジを洗浄してください。

滅菌水を用いて15回洗浄し、続いてさらに15回洗浄します。ハミルトンシリンジのプランジャーを曲げないように注意してください。曲がってしまうとプランジャーがスムーズに動作しなくなり、ダニへの注射に必要な繊細な操作ができなくなります。注射後、ダニを水と硫酸カリウムを満たした容器が入ったチャンバーに入れ、高湿度状態で1日間維持します。

次に、個々のマダニを羊に接着させた吸血セルに入れ、注入を行わなかった方の性の未注入マダニ（オスまたはメス）と同数ずつ合わせて吸血させます。約10日間の吸血完了後、または対照群のメスが宿主から脱落した時点で、吸血セルからメスのマダニを回収し、計量します。各グループのマダニを湿度チャンバー内で孵化させ、産卵が完了するまで培養します。グループごとの産卵量を評価するため、グループ内の全マダニによって産生された卵塊の重量を測定し、吸血後のマダニの表現型を評価します。

生存したマダニの数を測定し、マダニの体重、卵の位置、および卵の受精率を算出します。ターゲットとなる遺伝子や研究目的によっては、R-T-P-C-Rを用いて遺伝子サイレンシングを確認するために、その他の解析を行う場合があります。吸血後、コントロール注入群および二本鎖RNA注入群の個々のマダニから唾液腺と腸を解剖し、個々の組織サンプルから全RNAを抽出します。

リアルタイムR-T-P-C-Rを用いて個別の組織における標的遺伝子の転写物を分析し、RNAレベルをマダニの16 s ribosomal RNAで標準化します。gene norm法を用い、反応終了時に解離曲線を解析して、単一のアンプリコンのみが形成されていること、およびすべてのサンプルでアンプリコンが常に同一の温度範囲で変性することを確認します。その後、t検定を用いて、対照群を注射したマダニと二本鎖RNAを注射したマダニの間で、mRNAレベルの標準化されたCT値を比較します。

ここに記載するプロトコルは、当研究室において多くの異なる外寄生性マダニ種へのRNAiに利用されてきました。マダニに注入する二本鎖RNAの量は、マダニのサイズによって異なります。大型のマダニ種では、より多くの量を注入することが可能です。

参考文献は、本プロトコルの付随する文書に記載されています。プロトコルが正しく実施された場合、注入操作後24時間における死亡率は5%未満であるはずです。ここに、ダニにおける遺伝子ノックダウン後の典型的な表現型を示します。このパネルのダニには、ダニ保護抗原のスクリーニングに使用された二本鎖RNAのプールが注入されています。

光学顕微鏡で観察したダニにおいて、ダニ組織内の細胞変性が認められることがあります。表現型の変化は、機能喪失を伴う場合があります。例えば、SUBINのRNAiを行うと、メスと正常に交尾できない不妊のオスが生じます。RNA干渉およびダニに関する検討の結果です。

リアルタイムR-T-P-C-R、透過電子顕微鏡または共焦点顕微鏡、ゲノミクス、プロテオミクスなど、遺伝子サイレンシングが遺伝子およびタンパク質の発現、ならびにマダニの生物学的特性に及ぼす影響を判定するために他の手法を用いることができます。また、RNA干渉はマダニの細胞培養においても実施可能であり、マダニ細胞と病原体との相互作用を研究するためのin vitro手法を提供します。