内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌

この手順の全体的な目的は、特定の標的DNA配列に対するランダム変異体ライブラリを作成し、半定量的な機能選択を用いて変異体を迅速に同定および特性評価することです。まず、標的配列を含む単一の複製起点を持つpcoliプラスミドをムテータ株に形質転換します。細胞をプレートに播種し、一晩培養した後に回収し、標的プラスミドを単離して変異体ライブラリを得ます。その後、プロトコルの第2パートにおいて、変異の特性を評価するために、この変異体ライブラリをリードアウト株に形質転換します。勾配増殖プレートを作成し、リードアウト株の細菌培養液をソフトアガーを含む別のペトリ皿に導入します。

手順の最終ステップは、これらの細菌培養物をグラジエントにスタンプ転写することです。最終的に、薬剤グラジエント上での増殖の差を通じて、特定のターゲット配列の表現型プロファイルの変化を示す結果を得ることができます。このビデオでは、E. coliにおけるタンパク質の方向性進化の手法を紹介します。

このプロセスは、ランダムな栄養素ライブラリーの生成と、それに続く多様性を制限する選択という、自然な進化を模倣したものです。これにより、工業的または生物医学的な目的のための新しい生化学的活性を生成する能力が向上します。この手順は、ランダム変異ライブラリーの構築と、機能獲得変異を得るための機能選択の2つの構成要素からなります。この手順の実演は、私の研究室の技術者であるJennifer Allenが行います。

本プロトコルの開始前に、DNAポリメラーゼIの低忠実度変異体（low fidelity pol I）を発現する電気穿孔法用コンピテントJS 200細胞を準備します。これらの細胞は、書面によるプロトコルに記載されている通りに事前に調製されており、温度感受性pole 1アレルを含有しているため、37 °Cにおいて低忠実度pol I活性が支配的になります。標的配列が複製起点に隣接してクローニングされたcoli 1複製起点を含む標的プラスミドを構築します。低忠実度pol Iがcoli 1プラスミドの複製を開始することで、変異が導入され、変異誘発が開始されます。

2 mmギャップのキュベットに、40 µLの電気穿孔能（エレクトロコンピテント）細胞と30〜250 ngの標的プラズミドDNAを混合します。電撃装置を用いて、混合液に1800 Vでパルスを印加し、エレクトロポレーションを行います。各サンプルの条件下で均一な電気穿孔が行われていることを確認するため、時定数（TC）を確認してください。

理想的なTCは5〜6ミリ秒です。細胞とDNAの混合液を1mLのLB培地中で、37°C、250 RPMの振盪条件下で40分間回復させます。37°Cに予熱し、両方のプラスミドを選択するための適切な抗生物質を含む100mmのLV agroペトリ皿を用意します。回復させた細胞を、この例に示すような、個々のコロニーは識別できるが計数不可能な「ニアローン（near lawn）」濃度になる適切な希釈倍率でプレートに塗布します。

一晩の培養後、LBブロスを用いてペトリ皿の細菌コロニーを回収します。回収した細胞からプラスミドDNAを単離します。得られたプラスミドDNAがランダム変異ライブラリとなります。

ターゲットプラスミドとポールプラスミドの両方を線状化する制限酵素を用いて、プラスミドライブラリーの制限酵素消化を行います。単離したプラスミドDNAについて分析用アガロースゲル電気泳動を行い、品質と量を年確認します。プラスミドが確認されたら、ポールプラスミドは線状化し、ターゲットプラスミドは切断しない制限酵素を用いて、ライブラリー1 µgを消化します。

制限酵素消化の完了後、DNA精製キットを用いてライブラリーをクリーンアップします。最後に、精製したライブラリーをリードアウト株に形質転換し、変異を解析します。グラジエント調製を開始するには、正方形ペトリ皿の底面の一方の端に、等間隔に10本のレーンをマークします。

シャーレを下側のマークされた端が7 mm高くなるように傾斜させて配置します。適切な濃度の選択剤を十分に混合した温かいLBアガー25 mLを、傾斜させたシャーレに注ぎます。これがグラジエントの下層となります。

LBアガーがシャーレ全体を覆い、盛り上がった印のある端の厚さが約1 mm、低い部分の厚さが約8 mmになるようにします。換気のため蓋KUを軽く被せ、アガーを10〜15分間静置して凝固させます。LBアガーの下層が固まったら、シャーレを平らな面に移動させます。

次に、選択剤を含まない25 millilitersの温めたlb agarを注ぎ、最初のagri表面を覆い、底層全体が完全にカバーされるようにします。プレートに蓋KUをして通気させ、その後、細菌のスタンプ転写を行うためにagriを10から15分間静置して固めます。まず、リードアウト株の細菌培養液を用意し、600 nanometersにおける光学密度が1.0未満となるよう希釈して、細胞密度を同一にします。

次に、42°Cに平衡化した液体ソフトアガロース2 mLを100 mmのラウンドペトリ皿の底に移し、細菌培養液40 µLをソフトアガロースに加え、プレートを揺らして混合します。ガラス製顕微鏡スライドの長い方の端に、このソフトアガロース混合物を塗布します。その後、スライドの塗布した端をグラジエント皿の底にあるマークに合わせて配置します。

スライドをアガロースの表面に触れさせます。ソフトアガロースのリボン状の塊をグラジエント表面に転写するには、軽く触れるだけで十分です。その後、スライドは洗浄して再利用するために取り置いておきます。

この工程を繰り返します。残りのサンプルおよび実験対照を、各グラジエントディッシュに含めてください。複数のグラジエントを実施する場合は、グラジエントディッシュを逆さまにして37 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーションの時間と温度は、使用するリードアウト細菌株によって異なる場合がありますが、通常は37 °Cで一晩インキュベートすれば、目視可能な増殖が得られます。

最後に、記述されたプロトコルに従って細胞成長のイメージングおよび解析を行います。ここでは、変異導入されていないP-G-F-U-VまたはPG FPUV変異体ライブラリを形質転換し、4 roundsの変異導入を経て維持されたリードアウト株の画像を示します。コロニーが暗い、あるいは薄い場合は、GFPを不活性化させる変異を含むプラスミドであることを示しています。

この図は、ターゲットプラスミドの中立配列全体における変異の頻度を100 base pair間隔で示したものです。変異はプラスミド配列全体にわたって発生していますが、複製起点に最も近い領域で頻度が最も高いことに注意してください。ここでは、変異株の増殖を薬剤勾配に対して示しています。

グラジエントの上方向への成長距離は、変異体間における薬剤耐性プロファイルの違いを示しています。この例では、ヒト酸化脱メチル酵素ABH2のプラスミドライブラリを用い、薬剤選択グラジエントを用いてメチルメタンスルホネートに対する耐性が向上した変異体のスクリーニングを行いました。変異導入プロトコルを2回および4回繰り返したライブラリを、親株である野生型および空ベクターと比較して示しています。

白線は、個々の変異コロニーを分離した閾値を示しています。さらなる表現型解析のために、低忠実度P1変異導入およびastri-m選択を用いて previously 同定されたβ-ラクタマーゼ変異株 R 1 64 H および E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R を、0.4 µg/mL および 4 µg/mL のセフォタキシム濃度勾配上で示しています。セフォタキシムに対する保護能は、基質特異性拡大β-ラクタマーゼ（ESBL）活性を示しています。

野生型のβ-ラクタマーゼ酵素は、空ベクターを発現している細胞と比較して保護能を付与しないことに注意してください。したがって、これらの変異体は適応、あるいは新しい生化学的活性の進化を表しています。ここでは、このような新しい生化学的活性を生成するための、変異導入と機能的選択の強力な組み合わせを提示しました。

機能的な選択は、薬剤選択または遺伝的相補性のいずれかを通じて得ることができ、これにより大規模な遺伝的多様性を生成する能力を活用することが可能です。既存のタンパク質活性を最適化する場合や、部位特異的な変異導入を行う場合には、病原性を特定の配列に限定する必要があるかもしれません。これらはクローニングによって容易に実施できます。

さらに、シグネチャーアタックや変異フットプリントを得るために、変異導入を機能的な選択から切り離して行うことができます。