指向進化方法でサッカロマイセス・セレビシエ：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

このプロトコルの全体的な目標は、指向性進化実験のために出芽酵母の変異体ライブラリを構築およびスクリーニングする方法を示すことです。この方法は、アセンブルやクローニングにオーバーラップ領域をどのように割り当てるかなど、焦点を絞った指向性進化実験のためのラボ作成における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、そのシンプルさと堅牢性であり、たった1つの変換ステップで高品質のレベルを割り当てることができます。

変異体ライブラリを作成およびスクリーニングするためのこのプロトコルは、真菌のアリールアルコールオキシダーゼまたはAAOについて実証されます。焦点を絞った指向性進化の領域は、まず、利用可能な酵素の結晶構造または相同性モデルに基づく計算アルゴリズムの助けを借りて選択されます。AAOの2つの領域、すなわちM1領域とM2領域がランダム変異誘発と組換えの対象となります。

標的領域を増幅するために変異原性 PCR を実施します。酵母のin vivoスプライシングを促進するために、定義された領域のPCR反応を重ね合わせることにより、それぞれ約50塩基対のセグメント間の重なり合う領域が作成されます。50マイクロリットルの容量の変異原性PCRを調製し、それぞれが46ナノグラムのDNAテンプレート、センスおよびアンチセンスプライマーのそれぞれ90ナノモル、DNTPの0.3ミリモル、DMSOの3%、塩化マグネシウムの1.5ミリモル、塩化マンガンの05ミリモル、およびタックDNAポリメラーゼのマイクロリットルあたり05ユニット。

摂氏95度で2分間、摂氏95度で45秒間、摂氏50度で45秒間、摂氏74度で45秒間28サイクル、摂氏74度で10分間のPCRプログラムを使用します。AAO遺伝子の残りの部分であるHF領域は、変異原性セグメントと重なる対応する領域、および/または線形化されたベクターオーバーハングを含む高忠実度PCRによって増幅されます。

10ナノグラムのDNAテンプレート、各250ナノモルのセンスプライマーとアンチセンスプライマー、0.8ミリモルのDNTP、3%のDMSOを含む最終容量50マイクロリットルでハイフィデリティPCRを調製します。以下のPCRプログラムをご利用ください。98°Cで30秒、98°Cで10秒、55°Cで25秒、72°Cで45秒で28サイクル、72°Cで10分間です。

次に、すべてのPCRフラグメントを、製造元のプロトコルに従って市販のゲル抽出キットで精製します。次のステップは、ベクターを線形化して、ターゲット遺伝子の5つのプライム末端と3つのプライム末端に相同な約50塩基対の隣接領域を作成することです。2マイクログラムのDNA、7.5ユニットのBamH-one、7.5ユニットのXHO-one、20マイクログラムのBSA、および2マイクロリットルの10xバッファーBamH-oneを含む20マイクロリットルの直鎖化反応混合物を調製します。

反応混合物を摂氏37度で2時間40分間インキュベートします。その後、80°Cで反応を不活性化し、20分間放置します。直鎖状ベクターを精製して残留環状プラスミドによる汚染を回避するには、消化反応ミックスを半分取低融点アガロースゲルのメガウェルにロードします。

反応混合物の5マイクロリットルをレポーターとして隣接する井戸にロードします。DNA電気泳動を摂氏4度、電極間を5ボルト/センチメートルで行います。次に、メガウェルに対応するアガロースゲルを分離し、1つのXTAEに摂氏4度で保存します。

分子量ラダーとレポーターでレーンを染色します。UVライトの下でバンドを視覚化し、線形化されたベクトルが配置される位置に切り込みを入れます。UV光がない場合、染色されたレポーターレーンのニックのガイダンスを使用して、メガウェルフラグメントの線形化されたベクトルを特定し、それを切り取ります。

アガロースから直鎖状化ベクターを抽出し、メーカーのプロトコルに従って市販のゲル抽出キットで精製します。続いて、精製された直鎖状化ベクターをPCRフラグメントと混合し、このDNA混合物を使用して、製造元の指示に従って市販のキットを使用してコンピテント酵母細胞を形質転換します。形質転換細胞をSCドロップアウトプレートに播種し、摂氏30度で3日間インキュベートします。

このアッセイの準備として、SCドロップアウトプレートから個々のコロニーを取り出し、ウェルあたり50マイクロリットルの最小培地を含む96ウェルプレートに移します。各プレートで、親タイプを内部標準として6列目に接種します。ネガティブコントロールとして、ウラシルを添加したSC培地で満たされたH-ONに、プラスミドを含まないURA3陰性ESI内臓細胞をよく接種します。

プレートを蓋で覆い、パラフィルムで包み、湿度の高いシェーカーで摂氏30度で48時間インキュベートします。48時間後、160マイクロリットルの発現培地を各ウェルに加え、プレートを再シールします。さらに24時間インキュベートします。

プレートを遠心分離した後、液体処理ロボットマルチステーションを使用して、各プレートのウェルから20マイクロリットルの上清をレプリカプレートに移します。20マイクロリットルの2ミリモルP-メトキシベンジルアルコールと100ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液ph6.0を各ウェルに加えます。プレートを96ウェルプレートミキサーで短時間撹拌し、室温で30分間インキュベー

次に、各レプリカプレートに160マイクロリットルのFOXリーガントを追加し、ミキサーで短時間攪拌します。プレートリーダーで560ナノメートルのプレートを読み取ります。プレートを室温で色が現れるまでインキュベートします。

吸収を再度測定します。相対活性は、インキュベーション後の吸収値と初期測定値の差から、各プレートの親タイプに正規化されて計算されます。この代表的なゲル画像は、レーン 2 の直鎖状ベクター、レーン 3 の M1 PCR セグメント、レーン 4 の M2 PCR セグメント、レーン 5 の HF PCR セグメント、レーン 6 の NHE 1 と直鎖化された in vivo 再構成ベクターを示しています。

この次のゲルは、レーン 2 で再構成されたベクターのプラスミド ミニプレップ、レーン 3 で NHE 1 と直鎖化されたプラスミド、レーン 4 で BamH 1 と XHO 1 で直鎖化されたプラスミド、レーン 5 でゲル抽出とクリーンアップによって得られた直鎖化プラスミドを示しています。突然変異負荷は、異なるランドスケープの変異体ライブラリをサンプリングし、親酵素活性の10%未満のクローンの数を計算し、さらに活性バリアントと非アクティブバリアントのランダムサンプルをシーケンシングして検証することによって調整しました。このアッセイの検出限界の評価は、黒い円で表されるソルビトールの存在下でアッセイが線形であることを示しました。

白い四角で表されるソルビトールがない場合、直線性はより持続性がありましたが、応答は弱かった。AAO濃度と吸光度との間には線形相関が観察されました。2, 000クローンの変異ライブラリーを構築し、このアッセイでスクリーニングしました。

影付きの四角は、P-メトキシベンジルアルコールに対する分泌と活性が著しく改善されたAAO変異体を示しています。一度マスターすれば、適切に実行すれば、約4時間でミュータントライブラリを作ることができます。この手順を試みる際には、各PCRファミリーに適切なオーバーラップ領域と、in vivoスプライシングとクローニングのための直鎖状化ベクターを1つの形質転換ステップで割り当てることを忘れないようにすることが重要です。

同様のアプローチに従って、in vivo DNAサンプリング、飽和突然変異導入ライブラリ、DNAアセンブリなどの他の方法を実行して、変異ライブラリや代謝経路を構築することができます。その開発後、この技術は、バイオエンジニアリングの分野の研究者が活動、安定性を探求し、さらには無限の種類の相互作用を発明する道を開きました。このビデオを見れば、このSaccharomyces Cerevisiaeデバイスを図書館の建設とスクリーニングにどのように活用するかを十分に理解できるはずです