酵母のコロニーの埋め込み法

この手順の全体的な目的は、酵母コロニーを封入することです。まず、寒天プレートからコロニーとその下の寒天を除去し、それを溶融寒天の数滴の上に配置し、さらに溶融寒天で素早く覆うことでこれを達成します。次に、型に収まる十分な小ささにするため、コロニーから余分な溶融寒天を切り落とします。

その後、AER埋込コロニーを固定し、染色、脱水を行い、最終的にspurs樹脂で浸透させます。このブロックをspurs樹脂を入れた型に配置して硬化するまでインキュベートし、その後セクショニングを行います。最終的に、光顕微鏡または電子顕微鏡を用いて、酵母コロニー内における細胞型の分布を示す結果を得ることができます。

走査型電子顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、コロニーの内部構造を決定できることです。この手法は、コロニー内における細胞型の分布など、微生物の発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法によりcroce CACコロニーの構造に関する知見が得られましたが、他の微生物にも適用できる可能性があります。

コロニーの取り扱いと包埋は書面によるプロトコルのみでは習得が困難な場合があるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。本手法の着想は、胞子がコロニー内で均等に分布していないことを示唆した、2002年に発表した遺伝学的データに基づいています。私たちは、FinラボのEngelbergによって開発されたコロニー切片作成法を応用しました。

それでは、始めていきましょう。まず、Wild S visi 酵母を 30 °C のアガープレートで、約 300 個のコロニーが形成されるまで培養します。細いスパチュラを用いて、直径 1 ～ 2 mm のコロニーをプレートから 1 つずつ取り出します。

次に、1 mLピペットマンのチップを用いて、42°Cに温めた2%アガーを顕微鏡スライドガラス上に数滴滴下し、アガーが固まる前に、速やかにコロニーをアガーの上に（コロニー面を上にして）配置します。さらに数滴のアガーをコロニーの上に滴下し、コロニーの上部を含めた全体がアガーに包まれていることを確認しながら、アガーを凝固させます。以降のすべてのプロトコールステップでは、カミソリを用いて操作を行います。

コロニー周囲のAERをトリミングし、コロニーを含むAERブロックを、2%パラホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒド固定液を入れた3.5 mLのホウケイ酸ガラス製スクリューキャップバイアルに配置します。乾燥を防ぐため、コロニーは1つずつ処理する必要がありますが、最大10個のコロニーを同一のバイアルに入れることができます。コロニーを4 °Cで7日間静置します。

1週間後、固定液を除去し、約1.5 mLの0.15 M 酢酸ナトリウム（pH 7.2）を用いてアグリコロニーを2回洗浄します。各洗浄後、振盪せずに氷上で15分間インキュベートします。この洗浄操作をさらに2回繰り返します。

100 mM モノカリウムリン酸および 10 mM 塩化マグネシウムを含む pH 6.0 の 1× OS バッファーを 1.5 mL 使用し、各洗浄後に氷上で5分間インキュベートします。次に、同じバイアルを使用して、本ビデオおよび本プロトコルの記述部分に記載されているオスミウム処理と洗浄を行います。その後、再び同じバイアルを用いて、翌朝早々に、本ビデオおよび付属の記述プロトコルに記載されている段階的な脱水処理を行います。

こちらおよび付属の書面プロトコルに従って、spurs試薬を調製します。agriブロックを、室温の100%エタノール1.5 mLを用いて、10分間ずつ5回直ちに洗浄してください。最後のエタノール洗浄後、agriブロックが浸った状態を維持する程度にのみエタノールを除去します。

パステールピペットを用いて、spurs試薬を約0.5 millilitersバイアルに入れ、ローテーターを用いて低速で15分間回転させます。回転後、室温で30分間静置します。次に、溶液を完全に除去します。

次に、spurs試薬1.5 millilitersを加え、agriブロックを浸します。再び、バイアルをホイールに乗せて室温で15分間回転させ、その後30分間静置します。この洗浄工程を繰り返します。

さらに3回繰り返し、ステップを繰り返します。最後の30分が経過した後、spurs試薬を除去し、ブロックが浸るように新しいspurs試薬を加えます。agriブロックを室温で4時間静置してください。

spurs試薬を交換し、一晩回転させます。翌朝、spurs試薬を再度交換し、翌日までバイアルを回転させたままにします。さらに翌朝、番号付きのシリコン型にspurs試薬を入れ、型の底がちょうど隠れる量にします。

次に、アグリブロックをモールドに入れ、60°Cで4時間インキュベートします。4時間後、さらにスパーと試薬をモールドに満たし、60°Cで一晩インキュベートします。その後、切片作成のためにブロックをモールドから取り出します。

Wild S Visia酵母コロニーの中心部を通過する切片の光学顕微鏡写真の例をここに示します。この酵母は、樹木の浸出液から単離された野生型株です。コロニーは切片作成前に、YNA培地で6日間培養されました。

この画像では、asai、偽菌糸、および卵形酵母を容易に区別することができ、コロニーが下層のアガーに侵入している領域も明確に分かります。開いた矢印は代表的なasaiを、塗りつぶされた矢印は代表的な卵形栄養細胞を、塗りつぶされた矢頭は伸長した細胞の連鎖およびsiを示しています。この画像は、酵母の実験室株SH 1 0 2 0およびW 3 0 3の薄切片から得られた電子顕微鏡写真の一例であり、背景を示しています。

切片作成前に、コロニーをYNA培地で6日間培養しました。画像は、胞子形成細胞が高頻度に含まれるコロニーの領域を示しています。矢印は、胞子壁の二層構造を示しています。

パートAでは、4日目のコロニーの断面を示しており、パートBの画像には15個の長方形で構成されるグリッドが重ねられています。各長方形における胞子関連細胞の頻度が、パートAに示された15個の長方形に対応する15本のバーでグラフ化されています。データは、独立した4つの4日目コロニーの平均値および標準誤差です。パートCでは、独立した4つの8日目コロニーの平均値および標準誤差を示しています。この技術を習得すれば、丸1日の作業日と数日間の1〜3時間の作業時間を合わせて、2週間で完了させることができます。この手順を行う際は、ブロックが乾燥しないよう、溶液を速やかに添加することが重要です。

免疫電子顕微鏡法などの他の手法を用いることで、発生後の特定のタンパク質を発現している細胞の分布を決定できる可能性があります。この技術により、胞子形成細胞のパターニングだけでなく、croce CCIコロニーにおける偽菌糸細胞のパターニングも観察することができました。このビデオを視聴することで、切片作成のために酵母コロニーを包埋する方法について十分に理解できたはずです。

このプロトコルで使用される顕微鏡試薬の多くは、極めて危険なものがあることにご注意ください。必ずドラフトチャンバーを使用し、保護衣を着用し、試薬を適切に廃棄してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。