V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

この手順の全体的な目的は、患者の血漿からHIV RNAを抽出し、ウイルス外層遺伝子のV3領域をシーケンシングすることで、HIV感染患者におけるウイルスの向性を推測することです。次に、ネステッドRT-PCRを用いてHIV gp120のV3領域を増幅します。その後、ゲル電気泳動を用いて増幅産物の存在を確認し、続いて増幅されたV3産物の集団ベースのシーケンシングを行います。

最後に、ベースコーリングソフトを用いて配列を解析し、genome to phenoアルゴリズムを用いて共受容体の利用状況を推定します。最終的に、これらの結果から、HIV-1のV3ループの集団ベースのシーケンシングを通じて、患者のウイルス troop が R5 であるか非 R5 であるかを示すことができます。したがって、既存の表現型細胞ベースのアッセイなどの手法に対する本 troop アッセイの主な利点は、シーケンシング装置を備えたあらゆる研究室で、より低コストで、より短時間かつ少量の出発物質で実施できることです。

この手法は、500 µLの血漿から患者のウイルス集団がCCR5アンタゴニストに反応するかどうかを特定できるため、抗レトロウイルス療法による治療に関連しています。EasyMag自動抽出装置を使用してHIV RNAを抽出します。次に、ウイルス集団の適切なサンプリングを確実にするため、PCRクリーンルームに移動してRT-PCRのセットアップを行います。

このワンステップ反応において、各逆転写反応を3連（triplicate）で実施するように計画してください。ウイルスRNAを用いてcDNAを合成し、SQV 3 F1およびCO 6 0 2 primeプライマーを用いてHIVV 3領域を特異的に増幅します。1反応あたりの構成成分に基づいています。

リピーターピペットを使用して、増幅するサンプル数に十分な量のストックミックス溶液を調製します。PCRプレートの各ウェルに、サンプルミックスを36 µLずつ分注します。次に、マルチチャンネルピペットに切り替え、指定された各ウェルにRNAサンプル抽出液を数µLずつ分注します。この際、分注ごとに必ずチップを交換するようにしてください。

分注が完了したら、PCRストリップキャップでウェルを密閉します。次に、HIVV 3領域のワンステップRT-PCRを行うようプログラムされたサーマルサイクラーにPCRプレートをセットします。ネステッドPCRには、SQV 3 F2およびCD4 Rプライマーペアを使用します。

PCRクリーンルーム内での増幅サンプル数に基づき、必要な試薬量を算出します。ネステッドPCRミックスを調製し、リピーターピペットを用いてクリーンなPCRプレートの各ウェルに19 µLずつ分注します。RT-PCRの完了後、増幅後処理室へ移動してください。

8チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用して、1 µLのR-T-P-C-RテンプレートをネステッドPCRミックスに分注します。分注ごとにチップを交換してください。ウェルをPCRストリップキャップで密閉し、増幅のためにプレートをサーモサイクラーに移します。

温度が25 °Cに戻った後、サーモサイクラーからプレートを取り出します。V3領域が正常に増幅されたか確認するため、まずゲル電気泳動により産物を分析します。CyberSafeゲル染色剤を用いて1.6%アガロースゲルを調製します。

10 µLのマルチチャンネルピペットを使用します。8 µLのPCRサンプルをそれぞれのウェルに分注します。また、各行の少なくとも1つのウェルにDNAラダーをロードします。

ゲルを約100 Vで10分間電気泳動します。紫外線蛍光によりバンドを可視化し、写真を撮影して記録します。3回すべてで増幅が成功したサンプルを記録してください。

必要に応じて、産物の増幅が3回未満のサンプルについてR-T-P-C-Rを繰り返します。増幅したウイルスCDNAサンプルは、V 3 0 2 FおよびS QV three R oneプライマーを用いたDNAシーケンシング反応によりさらに検証します。big di試薬をフリーザーから取り出し、室温で解凍します。

解析するサンプル数に基づき、必要な試薬を計算して調製します。マルチチャンネルピペットを使用して、5 µLのシーケンシング反応ミックスを適切なプレートウェルに分注します。プレートをキムワイプで覆い、脇に置いておきます。

その間に、残りのPCR産物に滅菌水を180 µL加えて、増幅したPCR産物を1:15に希釈します。希釈したサンプルを1 µL、適切なプレートのウェルの底にピペッティングします。サンプルの転送が完了するたびに、必ずチップを交換してください。

プレートをストリップキャップで密閉し、1秒間ボルテックスします。プレートを遠心分離するため、速度を140 5Gに設定します。回転速度が140 5Gに達したら、回転を停止させます。

反応を進行させるため、プレートをサーモサイクラーに入れます。各ウェルに、3 M 酢酸ナトリウム 4 µL と冷却した 95% エタノール 40 µL を加えて DNA を沈殿させ、キャップを再度密閉します。プレートを 10 秒間ボルテックスし、プレートを軽く叩いて気泡を除去します。

プレートを-20°Cで30分から2時間の間静置します。2000 ×gで20分間遠心分離し、DNAを回収します。ストリップキャップを取り外し、廃棄します。

プレートを廃棄容器の上に反転させ、上清をデカントします。反転させたプレートをペーパータオルで吸い取り、残った上清を完全に取り除きます。

ペーパータオル2枚を折り畳み、プレートを挟みます。プレートを伏せた状態で遠心分離機にセットし、140 5Gで遠心分離を行います。140 5Gに達した時点で回転を停止させます。

次に、155 µLの95% ethanolで洗浄し、上清を捨てます。その後、遠心分離を繰り返します。プレートを2〜5分間放置し、残っている ethanolを完全に蒸発させます。

DNAサンプルを変性させるため、マルチチャンネルピペットを使用して、空のウェルを含むプレート上のすべてのウェルに10 µLの高濃度ダイを分注します。プレートをセプタムで密封し、サーモサイクラーを用いて90 °Cで2分間加熱します。最後に、サンプルプレートをシーケンシングプレートにセットし、シーケンサーに装入します。

データ解析の有効な手法の一つとして、人の介入なしに自動ベースコールを行うソフトウェア「recall」の使用が挙げられます。Recallは無料で利用可能なカスタムベースコール用ソフトウェアです。ログイン後、「browse」オプションを使用してアップロードするサンプルファイルを選択してください。生シークエンシングデータファイルを指定し、最大20 megabytesまでアップロードしてください。

次に、リファレンス配列をV3に設定します。[process data]をクリックしてください。ページ右側で生成されたフォルダを選択し、サンプルの一覧を表示します。

赤色のものは不合格、緑色のものは合格を示しています。特定のサンプルを選択して表示ボタンをクリックすると、シーケンスを確認でき、ページ右側の指示に従ってシーケンス内を移動したり、ファイルをzipフォルダとしてダウンロードしたりすることが可能です。

ウイルスの親和性（トロピズム）は、geno to pheno共受容体アルゴリズムを用いた集団ベースのシーケンシングによって生成された配列から推測できます。significant設定のドロップダウンメニューから、motivate 2%および5.75%FPRの臨床データの分析に基づいた最適化オプションを選択してください。次に、解析する配列をアップロードするか、ペーストして選択してください。

FASTAファイルが使用可能です。CCR5拮抗薬に対する反応性を予測するためのgeno Tono FPRA予測因子の取得へ進んでください。生成されたG2Pレポートには、アミノ酸によるV3ループ配列が示されており、非R5指向性ウイルスに関連する変異の該当箇所が明記されています。

レポートの最下部には、CCR5アンタゴニストへの反応性に基づいた偽陽性率が記載され、解釈されています。このレポートはPDFファイルとしてダウンロード可能です。サンプルの3つの配列のいずれかが非R5と推定された場合、その患者はCCR5アンタゴニストに期待通りに反応しない可能性が高くなります。HIV-1 V3ループのRTP-CR増幅産物のゲル電気泳動の結果、すべての臨床サンプルで産物が生成されるわけではないことが示されています。

増幅サンプルから得られた生成配列は、recallで読み取ったクロマトグラムで視覚化できます。混合物が少なく、クリーンな配列が得られることが期待されます。場合によっては、配列が乱れており、正確な塩基割り当てが困難なことがあります。

ここに示すように、一部の患者ではnon CCR five 使用ウイルスが検出されることがあります。これらの患者は、CCR five 拮抗薬による治療に反応する可能性は低いです。しかしながら、大多数の患者では、G two P 解析レポートの下部にある緑色のボックスで示されるように、CCR five 使用ウイルスで構成されるウイルス集団が認められます。

習得すれば、この手法は抽出から分析まで、最初から最後まででおよそ4日間で実施可能です。このビデオを視聴することで、genome pheno バイオインフォマティクスアルゴリズムを用いた集団ベースのシーケンシング法により、ウイルスの向性を予測する方法を十分に理解できるはずです。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。