評価するために制限酵素ベースのクローニング方法

この手順の全体的な目的は、サブタイプCのHIV-1感染者由来のgag遺伝子を複製能を持つHIV-1プラスミドに組み込み、in vitroにおけるHIV-1の複製能に対するgag配列の多型による影響を評価することです。まず、患者の血漿からgag遺伝子を増幅させることでこれを達成します。第2のステップでは、患者由来のgag配列を、複製能を持つ感染性分子クローンMJ-fourにクローニングします。次に、gag-MJ-fourキメラプラスミドをトランスフェクションして感染性ウイルスストックを調製し、インジケーター細胞株を用いて感染価を測定し、感染性を評価します。最終ステップでは、GXR-25 T細胞株におけるin vitro複製能を測定します。最終的に、放射標識逆転写酵素アッセイを用いて、ウイルス複製キネティクスを可視化するために、時間経過に伴うビリオン産生量を定量します。

本日解説する手法は、HIV研究分野における重要な課題の解決に役立ちます。これには、HIVの複製適応度の決定要因の定義や、HIVの適応度が長期的な病原性にどのように影響するかを理解することが含まれます。本日の手法の解説は、私の大学院生であるJessica PrinceとDan Claiborneの2名が担当します。

この手順を開始するために、ワンステップRT-PCRを用いて、逆転写酵素および耐熱性DNAポリメラーゼによりRNAからcDNAを逆転写し、第1ラウンドのDNA産物を増幅させます。次に、第1ラウンドのPCR増幅産物1 µLをDNA鋳型として用い、ネステッド第2ラウンドPCR増幅を行います。続いて、第2ラウンドの反応液5 µLに5Xローディングダイを3 µL加えます。

UV蛍光DNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲル上で、バンドが分離するまで120 Vで電気泳動を行います。次に、ブルーライトイルミネーターで1.6 KBのバンドを視認します。その後、残りの45 µLの反応液を、DNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲル上で電気泳動します。清潔なカミソリの刃で適切なバンドを切り出し、個体あたり3つの陽性反応分をまとめます。続いて、ゲル精製キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出し、ヌクレアーゼフリー水で溶出させます。得られた産物は、後で使用するために-20 °Cで凍結保存します。0:15:56 この手順では、MJ-fourプラスミドのlong terminal repeat 5' UTR領域を増幅させた後、1.3 KBのPCR産物をイルミネーターで視認します。陽性アンプリコンを切り出し、前述の方法で精製し、凍結保存します。次に、スプライスオーバーラップ伸長PCR（splice overlap extension PCR）により、融合MJ-four LTR gagアンプリコンを作製します。3.2 kbの長いアンプリコンを視認、切り出し、精製し、凍結保存します。ここで、1.5 µgのMJ-fourプラスミドと1.5 µgの精製LTR-gag PCR産物を、BclI制限エンドヌクレアーゼを用いて50 °Cで1.5時間消化します。続いて、消化反応液に1 µLのNGOM-fourを加え、37 °Cで1時間インキュベートします。その後、制限酵素消化反応液に5xローディングダイを添加します。全量を、DNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲル上で、100 Vで1〜2時間かけてゆっくりと電気泳動します。前述の方法で、クローニングのために目的のバンドを視認、切り出し、精製します。

次に、精製したLTR-gagインサートとMJ-fourベクターDNAを用い、インサートとベクターの比率を3:1にしてライゲーション反応液を調製します。ライゲーション反応液を4°Cで一晩インキュベートします。

次に、100 µg/mLのAmpicillinを含むLB寒天培地に、ライゲーション産物を用いてJM-109化学的コンピテント細胞を形質転換します。形質転換した細菌を30 °Cで少なくとも22時間培養します。クローニングの正確性を確認するため、ミニプレップDNAをNGOM-fourおよびHPA-one制限酵素で37 °Cで2時間ダブルダイジェストします。

その後、1%アガロースTAEゲルで分析します。TZM-BL細胞アッセイによる1 µLあたりのIU力価に基づき、5×10⁵個のGXR-25細胞を0.05の感染多重度（MOI）で感染させるために必要な各ストックのウイルス量を算出します。複製能を有するHIVを取り扱う際は、フルガウン、フェイスマスク、二重手袋を含む適切な個人用保護具を必ず着用してください。感染当日、ウイルスストックを-80 °Cのフリーザーから取り出して解凍します。次に、0.05 MOIにするため、ウイルスをC-R-P-M-I培地で100 µLに希釈します。これをV底組織培養処理済み96ウェルプレートに添加します。その際、各複製実験セットにポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を含め、ウェル間のクロスコンタミネーションを制限するために1列おきに空列を設けてプレートを構成します。その後、自動細胞計数器を用いてGXR-25細胞をカウントし、すべての感染に必要な総細胞数を算出します。必要な容量を50 mLコニカルチューブに分注し、遠心して細胞をペレット化します。次に、培地を慎重に吸引し、C-R-P-M-Iを用いて100 µLあたり5×10⁵個の濃度に再懸濁します。細胞を滅菌済みのリザーバーに移し、十分に混ぜ合わせます。続いて、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈ウイルスを含む96ウェルプレートの各ウェルに細胞を100 µLずつ加え、十分に混ぜます。その後、各ウェルに5 mg/mLのポリブレン溶液を2 µL加え、細胞を十分に混合します。その後、5% CO2濃度の組織培養インキュベーター内にて37 °Cで3時間インキュベートします。

感染細胞を洗浄するために、96ウェルV底プレートを遠心分離して細胞をペレット化します。次に、培地150 µLを慎重に取り除き、細胞ペレットを乱さないように新鮮なC-R-P-M-I 150 µLと置換します。この手順をさらに2回繰り返し、細胞を十分に洗浄します。最後の遠心分離後、150 µLのC-R-P-M-Iを添加し、マルチチャンネルピペットを用いて細胞ペレットを再懸濁します。各ウェルの混合液を、24ウェル組織培養プレートのウェルにある800 µLのC-R-P-M-Iに加えます。その後、プレートを37 °C、5% CO2の組織培養インキュベーターに入れます。2日ごとに、培養ウェルの表面から上清100 µLを96ウェルU底プレートのウェルに移し、後のRTアッセイによる分析のために冷凍保存します。その後、細胞を十分に再懸濁し、細胞の過増殖を防ぐために残りの液量の半分を取り除きます。その後、各ウェルに新鮮なC-R-P-M-I 550 µLを添加し、元の液量に戻します。

この手順では、1 mLのRTマスターミックスの分注量それぞれに、10 mCi/mLのDTTPを1〜2 µL、および1 MのDTTを4 µL加えます。1.5 mLマイクロ遠心チューブに入ったRTマスターミックス、DTT、DTTPの混合物を、1000 µLピペットを用いて慎重に混合し、滅菌済みのトラフに移します。

次に、ラベル付けされたRTミックスを25 µLずつ、96ウェル薄壁PCRプレートの各ウェルに分注します。各上清5 µLを、RTマスターミックスを含むPCRプレートに加えます。その後、PCRプレートを粘着剤付きフォイルカバーで密封し、サーモサイクラーを用いて37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、200 µLマルチチャンネルピペットを使用して、フォイルカバーに小さな穴を開けます。サンプルを5回混ぜ合わせます。各サンプル5 µLをDE-81ペーパーに移し、すべてのサンプルを10分間自然乾燥させます。ブロットを個別の洗浄容器に入れます。続いて、ブロットを1X SSCで5回洗浄します。その後、90%エタノールで1回につき5分間、2回洗浄し、自然乾燥させます。乾燥後、ブロットをサランラップで丁寧に包み、密閉したカセットに入れて、室温で一晩ホスホスクリーンに感光させます。

準備が整ったら、フォスフォーイメージャーを用いてフォスフォスクリーンを解析し、放射性転写産物量を定量します。

図示。ここでは、MJ-fourプラスミドバックボーンにクローニング可能な患者由来gagアンプリコンを生成するために必要な、さまざまなPCRアンプリコンの電気泳動分離を示す代表的なゲル画像を示します。この代表的なゲル画像は、患者のgag遺伝子をMJ-fourにクローニングするための制限酵素消化物の電気泳動分離を示しています。

この代表的なゲル画像は、精製したgag MJ-fourキメラプラスミドDNAの制限酵素消化による電気泳動分離を示しています。このグラフは、GXR-25細胞株における複製アッセイの経時的な再現性を示しています。約1年の間隔を空けて実施された2回の独立した実験において、同一のgag MJ-fourキメラウイルスを用いてGXR-25細胞に感染させました。

複製スコアは、対数変換したDLU値の傾きを算出し、その傾きを野生型MJ-fourで正規化することによって算出しました。2つの独立した測定値は強い相関を示しており、異なる時期に異なる継代数の細胞を用いて実施したアッセイの再現性が強調されています。この手法は、世界で最も普及しているサブタイプである急性サブタイプC感染における病原性のウイルス決定因子の探索という、HIV/AIDS分野の研究者に道を開きました。複製能を持つHIVを扱うことは極めて危険な場合があります。生ウイルスを扱うすべての工程は、BSL 2+施設で実施する必要があります。すべての表面は定期的に除染し、常に二重手袋を着用してください。