効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ

本手順の全体的な目的は、SCO Metre プロトプラストを形質転換することです。まず、植物を Drizly で消化します。次に、プロトプラストをマンニトールで洗浄して Drizly を除去し、その後、DNA および PEG と共にインキュベートします。

最後に、形質転換したプロトプラストをプレート上に播種し、インキュベートします。これにより、最終的な結果を得ることができます。蛍光顕微鏡を通じて、蛍光標識タンパク質を発現している形質転換プロトプラストが観察されます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるY luが行います。

この手法の主な利点は、効果的であり、目的のタンパク質を発現するプロトプラストを安定して生成できることです。コケのプロトプラストを単離するには、まずスパチュラを用いて8%マンニトール 9 mLをペトリ皿に入れます。2～3枚のPP NH4プレートから、5～7日経過したコケをマンニトールの中に入れます。これおよびその他の試薬の調製方法については、付随する書面プロトコルを参照してください。次に、2%ドリズリー 3 mLを加え、室温で緩やかに振盪しながら1時間インキュベートします。

混合物を100 micronのメッシュでろ過し、緑色の均一な懸濁液を得ます。次に、ろ液を250 Gで5分間遠心分離します。上澄み液を非常に慎重に除去してください。

プロトプラストを500 µLの8% mannitolに再懸濁します。次に、さらに9.5 mLの8% mannitolを加えます。プロトプラストが完全に懸濁していることを確認してください。

溶液を再度 250 G で5分間遠心分離し、洗浄工程をさらに2回繰り返します。上清を廃棄し、プロトプラストを再懸濁します。まず 500 microliters で行います。

次に、ヘモサイトメーターを用いて8%マンニトールを9.5 milliliters加えます。分離したプロトプラストにDNAを導入するため、懸濁液10 microliters中のプロトプラスト数を計測します。まず、プロトプラスト混合液を250 Gで5分間遠心分離します。

上清を除去し、プロトプラストをMMG溶液中で1.6 million/mLの濃度で再懸濁します。この懸濁液を室温で20分間インキュベートします。次に、60 µgのDNAを含む培養チューブに、プロトプラスト溶液600 µLを添加します。振盪して混ぜ合わせます。

700 µLのPEGカルシウム溶液を静かに加え、振とうします。この待機時間の間、サンプルを室温で30分間十分にインキュベートします。PRMBプレートをセロファンで覆います。

次に、懸濁液を3 mLのW5溶液で希釈し、250 Gで5分間遠心分離します。PEGを除去するため、プロトプラストを2 mLのPRMTで再懸濁し、セロファンで覆ったPRMBプレートに1 mLずつ播種します。プレートを25 °Cの育成室で保持します。

最後に、形質転換の4日後に、セロファンを新しい選抜プレートに移します。この図は、ハイグロマイシン耐性カセットを持つ15 µgの超らせん状プラスミドDNAで形質転換し、プロトプラストから再分化した18日目の植物の例を示しています。ここでは、同等の30 µgの超らせん状プラスミドDNAをプロトプラストに形質転換させました。

このサンプルには60 microgramsのplaid DNAが形質転換されました。そして最終的に、ハイグロマイシン耐性カセットを持つ同じ超共役プラスミドDNAを120 micrograms形質転換したプロトプラストから、これらの植物が再生されました。形質転換効率は、最大60 microgramsまでのDNA濃度では影響を受けません。

しかしながら、DNA濃度が高すぎるとこの手順に悪影響を及ぼします。データによれば、この方法は広範囲のDNA量において、1回あたり一貫した結果が得られることが示されています。適切に実施すれば、この手法は3時間で完了できます。

この手順に続き、遺伝子機能に関するさらなる疑問を解消するために、一過性RNAiや遺伝子ノックアウトなどの追加手法を実施することができます。