ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

このプロトコルの全体的な目標は、植物のプロトプラストの迅速で自動化されたハイスループットスクリーニングの方法を開発することであり、特に、多数のゲノム編集および遺伝子サイレンシングターゲットの早期スクリーニングにおける現在のボトルネックに対処することです。この方法は、植物バイオテクノロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子発現におけるプロモーター機能の迅速な並列スクリーニングのためのハイスループットな自動プロトプラスト産生および形質転換を可能にすることです。

この手順は、広く使用されているタバコの明るい黄色の2つ、またはBY-2懸濁液培養を使用して示されます。まず、プロトコールのテキストに記載されているように、三角フラスコでBY-2培養物を培養します。プロトプラスト単離の日には、細胞が急速に沈静するように培養物を完全に混合し、培養物の6ミリリットルを15ミリリットルの円錐底遠心チューブに移します。

細胞を少なくとも10分間落ち着かせます。適切な量の上清を除去して、パックされたセル容量を総容量の50%に調整します。チューブを反転させて振とうし、ワイドボアピペットを使用して、消化のために500マイクロリットルの細胞懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。

この手順の最初のステップは、マイクロプレートムーバー、リキッドハンドラー、マルチモードプレートリーダー、マルチモードディスペンサー、プレートヒーターまたはチラー、およびコンピューターであるロボットシステムのすべてのコンポーネントの電源を入れることです。次に、マイクロプレートムーバーを他の機器と統合して、各機器間でプレートを移動できるようにするプレートムーバータスクスケジューリングソフトウェアを開きます。プレートムーバーソフトウェアで、プロトコールで使用するラボウェアの技術仕様を定義します。

メインツールバーの「設定」をクリックし、「コンテナタイプの管理」コマンドを選択します。既存のコンテナタイプのリストから適切なコンテナタイプを選択します。プレートムーバーが遭遇するすべての実験器具の技術仕様を定義します。

次の手順では、各コンテナの開始位置と終了位置を定義します。特定のプロトコルの [Start/End] タブをクリックします。各コンテナの 開始位置 を選択し、開始位置と終了位置の両方で Lidded、Unlidded のチェックボックスをオンにします。

各ラボウェアの開始位置と終了位置を定義したら、ワークフロー全体の開始位置にすべてのプレートを手動でロードします。96ウェル蛍光スクリーニングプレートをホテル2に、BY-2細胞を含む6ウェルプレートをホテル3に、プレートヒーターまたはチラーのネスト2への形質転換に使用される96ディープウェルプレート、および酵素溶液を含む50ミリリットルのコニカルチューブをマルチモードディスペンサーにロードします。プロトコールで形質転換を行うには、96ディープウェルプレートの各ウェルに、オレンジ色の蛍光タンパク質レポーターコンストラクトを含む10マイクロリットルの血漿DNAをプリロードし、プレートヒーターまたはチラーで摂氏4度でインキュベー

指定された場所にある自動リキッドハンドリングプラットフォームにすべての消耗品とプレートをロードします。1列目のウェルあたり200マイクロリットルの40%ポリエチレングリコール溶液をプリロードした96ウェルプレートをロードします。ピペットチップの箱をネスト8にロードします。

自動リキッドハンドリングプラットフォームソフトウェアで各アイテムの位置を定義するには、メニューから「ツール」を選択し、「Labware Editor」をクリックします。プルダウンメニューから実験器具の種類を選択します。「Main Protocol」タブを選択し、「Configure Labware」をクリックして、各ラボウェアの位置を定義します。

[実行] をクリックして、プロトコルで使用されるすべてのデバイスを初期化します。最後に、「Work Explorer」ウィンドウで「Add Work Unit」をクリックし、システム内のすべてのラボウェアを確認し、自動プロトコルを開始します。この手順の最も敏感な部分は、プロトプラスト形質転換です。

変換はロボットシステムによって実行されるため、自動化されたプロトコルが正しく設定されていることが重要です。このビデオでは、自動プロトコルの選択されたステップのみが表示されます。形質転換プロトコルでは、自動リキッドハンドリングプラットフォームが6ウェルプレートから70マイクロリットルのプロトプラスト溶液を吸引し、ネスト6の96ディープウェルプレートに分注します。

次に、新しいピペットチップを使用して、プリロードされたディープウェルプレートから70マイクロリットルの高粘度ポリエチレングリコール溶液をゆっくりと吸引し、溶液をディープウェルプレートの該当するウェルに完全に分注します。次に、自動化されたリキッドハンドリングプラットフォームがディープウェルプレートを次の6つからネスト9に移動し、プレートムーバーがプレートをピックアップしてプレートシェーカーステーションに移動し、1500RPMで30秒間振とうします。プロトプラストの平衡化を可能にするために振とうせずに20分間インキュベートした後、プレートムーバーは96ディープウェルプレートをマルチモードディスペンサーに移動し、洗浄プロトコルをトリガーします。

自動化されたプロトプラストの単離および形質転換プロトコルが完了したら、形質転換されたプロトプラストの入ったプレートをロボティクスシステムのホテル1から取り外します。倒立顕微鏡、カメラ、蛍光灯をオンにします。10X対物レンズを選択して、プロトプラストに最初に焦点を合わせます。

ハロゲンランプを点灯し、蛍光灯のシャッターを閉めます。プレートを顕微鏡システムにロードし、明視野を使用してプロトプラストに焦点を合わせます。次に、ハロゲン電球を消し、蛍光灯のシャッターを開けます。

トランスジェニックプロトプラストによって発現されるオレンジ色の蛍光タンパク質を可視化するためのCy3/TRITCフィルターセットを選択します。各ウェルをスキャンして、蛍光マーカーを発現するプロトプラストの数を決定します。このプロトコルで指定された条件でのプロトプラストの酵素消化により、6ウェルプレートあたり2,820,000個のプロトプラストが得られました。

プロトコールの各移管ステップ後のプロトプラスト濃度の損失を評価しました。消化プロトコルの後、11, 500個のプロトプラストを96ディープウェルプレートの各ウェルに移しました。形質転換プロトコルが完了すると、1, 230個のプロトプラストを96ウェル蛍光スクリーニングプレートに移しました。

複数のピペッティングステージがプロトプラストに損傷を与えないように、ヨウ化プロピジウム染色によりプロトプラストの生存率をアッセイしました。その結果、消化後、96ウェル蛍光スクリーニングプレートに移した後、および形質転換プロトコル後の生存率に有意差は示されませんでした。形質転換プロトコルは、オレンジ色の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック細胞を作製することに成功しましたが、形質転換効率はわずか約2%でしたこれは、大きなバイナリープラスムが使用され、プロトコルがBY-2プロトプラストに特異的に最適化されていなかったためです。

プロトコルの時間経過について得られた指標は、消化段階で大きな時間の投資が費やされることを示しました。プロトプラストの単離と形質転換の全時間は3時間50分53秒で、オペレーターからの外部入力は必要ありませんでした。適切に設定すれば、この手法はロボットで4時間以内に実行できます。

この技術は、その開発後、植物バイオテクノロジーの分野の研究者がゲノム編集やプロモータースクリーニングなどのハイスループットな作物ゲノム手順を実行するための道を開きつつあります。