遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

この手順の全体的な目的は、生存細胞におけるミトコンドリア内のカルシウム濃度の変化をモニターすることです。これはまず、ミトコンドリアマトリックスに標的化されたカルシウムインジケータータンパク質のレシオメトリック指標であるperamを細胞に導入し、その1〜2日後に蛍光顕微鏡およびソフトウェアを用いて生存細胞イメージングを行うことで達成されます。

カルシウム動員アゴニストを添加し、レシオメトリックなPeram発現細胞の画像を撮影します。手順の最終ステップは、取得した画像の定量解析です。これにより、レシオメトリックなカルシウムインジケータータンパク質を発現する生細胞の蛍光顕微鏡観察を通じて、ミトコンドリア内カルシウム濃度の動的な変化を示す結果を得ることができます。

合成カルシウムインジケーターを用いたカルシウム濃度の測定などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ratiometric Pericamが遺伝子にコードされており、ミトコンドリアやその他の任意のオルガネラを標的にできる点にあります。こんにちは、Dr. Benningの研究室のポストドクであるDr. Ascarです。本日は私が手順を実演します。プロトコルの開始にあたり、前日にHeLa細胞を播種します。翌日のトランスフェクション時に約70%のコンフルエントになる密度で、標準的な6ウェル培養プレートに配置した滅菌済みガラスカバースリップ上に播種してください。翌日、製造元の指示に従ってDNA-Lipofectamine 2000複合体を調製します。トランスフェクションを行う各ウェルにつき、4 µgのratiometric Pericamミトコンドリア発現ベクターと、0.5 mLのOpti-MEMに希釈した10 µLのLipofectamine 2000を使用します。

次に、各ウェルのD-M-E-M-F-B-S HELOC培養液を、抗生物質を含まない同培養液 1.5 milliliters で置換します。DNA溶液にLIPECTOMY溶液を加え、複合体が形成された後に静かに混合します。DNA Lipectomy溶液をトランスフェクションを行う各ウェルに滴下し、プレートを静かに揺らして混合した後、37 degrees Celsius、5%carbon dioxide の細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートします。

培地を抗生物質含有D-M-E-M-F-B-Sに交換します。ピンセットを用いてイメージングを行う前に、1〜2日間細胞にmetric peramを発現させます。HELOC細胞を播種したカバースリップを、イメージング溶液が入った適切なイメージングチャンバーに静かに配置します。

イメージングチャンバーを倒立顕微鏡のステージに設置します。次に、40倍以上の油浸対物レンズと380 nanometersの波長を使用します。1つまたは複数のレシオメトリックperamを発現している細胞を含む関心領域を特定するために、ここでは細胞をレシオメトリックとして識別するための380 nanometersを使用します。

Peramはこの波長において光退色への耐性が低くなります。関心領域を特定した後、ソフトウェアを495および380ナノメートルの二波長励起に設定します。次に、495および380ナノメートルで交互に励起させ、順次画像を撮影します。

アゴニストを添加する前に、ベースラインのカルシウムレベルの画像を少なくとも30秒間取得します。次に、灌流装置を用いてカルシウム動員アゴニストを添加し、各アゴニスト暴露の添加時間を記録します。また、十分な時間分解能を維持しつつフォトブリーチングを防ぐために、露光時間と取得間隔を最適化する必要があります。実験完了後、画像はオフラインで解析することができます。

解析を開始するには、必要に応じて背景蛍光を差し引くため、視野内の空白領域から関心領域（ROI）を選択します。次に、関心領域から得られた 4 95 3 80 比の測定値をExcelまたは同様のグラフ作成ソフトにエクスポートします。この画像パネルは、比率計量的 peram およびミトコンドリアの細胞内局在を示しています。

左側は、ラシオメトリックPericamを発現しているHeLa細胞の生細胞画像です。中央は、ミトコンドリアの蛍光染色および選択的染料であるMitoTracker Red CMXRosによる染色結果です。そして右側に示すマージ画像は、ミトコンドリアにラシオメトリックPericamを発現し、10 µMのATPで処理した4つのHeLa細胞の、495 nmおよび380 nmのラシオ擬似カラー画像です。また、こちらの画像には、ミトコンドリアにラシオメトリックPericamを発現したHeLa細胞における、前述の4つの細胞のミトコンドリアカルシウムレベルの変化の定量結果が示されています。

0.5 µMのstaurosporineで60分間処理すると、個々のミトコンドリアにおけるカルシウム応答の不均一性と、顕著なミトコンドリアの断片化が認められます。白矢印で示されるように、カルシウムレベルが振動的に上昇するミトコンドリアがある一方で、黄矢印で示されるように、カルシウムレベルに有意な変化が見られないものもあります。このグラフは、0.5 µMのstaurosporineで120分間アポトーシスを誘導した後の、単一のHeLa細胞におけるミトコンドリア全体のカルシウムレベルの変化を示しています。

このビデオを視聴することで、ミトコンドリアマトリックスに選択的に標的化されたカルシウム感受性タンパク質R-GECOを用いて、さまざまな刺激に応答したミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変化を測定する方法について、十分な理解を得ることができます。