マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ

この手順の全体的な目的は、酸化ストレス下にある酵母の発現差を調べることで、科学系の学部生にマイクロアレイ技術を導入することです。これは、まず過酸化水素で処理した酵母培養液および未処理の対照群から全RNAを単離することによって達成されます。手順の第2段階では、これらのRNAサンプルからcDNAを合成し、精製します。

次に、このcDNAを用いて、in vitro転写によりビオチン標識cRNAを調製します。本手順の最終ステップは、AFI metrics社製酵母ジーンチップへのハイブリダイゼーションに向けた、ビオチン標識cRNAのフラグメンテーションです。最終的に、2つの酵母サンプルの発現差を示す結果が得られ、バイオインフォマティクスを通じて、学部生にマイクロアレイ解析の有用性を実証することができます。

Vermont Genetics Network Outreachチームがこの手法を考案したのは、バーモント州全域の科学を学ぶ学生の科学教育を充実させるため、マイクロアレイ技術を導入するという任務を担ったときのことでした。現在までに、州内の8つの学士課程大学にある複数の施設でこの手法が導入されています。したがって、教育モジュールにマイクロアレイを使用する主な利点は、ラボで日常的に用いられている一般的な分子生物学的手法を、グループ形式で指導できる点にあります。

また、これを学生や教師、そして私たちのグループへの教育に活用することもできます。実際には、学生と教授が同じプロジェクトで共同に取り組んでいます。彼らは、RNAの取り扱いのように、容易ではなく高度な熟練を要する特定の技術を習得します。

可視化試薬を用いてDNAを沈殿させる方法を学びます。大学院での研究や日常的な分子生物学研究室で実際に直面することになる技術を、実際に体験することができます。この手法は酸化ストレスや酵母に関する知見を得るのに適していますが、検討したい他のモデル生物や他の生物学的システムにももちろん適用可能です。

遺伝子発現の変化は、発生上の変化、環境毒素、特定の疾患状態など、非常に多くの要因に関連しています。酸化ストレスを受けている酵母における発現の違いを調べるため、まず酵素的溶解により2つの酵母培養液から全RNAを抽出します。一方の培養液には、HBSS（ハンクス平衡塩溶液）中の0.5 millimolar 過酸化水素を用いて1時間の処理を行い酸化ストレスを与え、もう一方の培養液には対照としてHBSSのみで処理を行いました。

まず、2本の1.7 milliliterマイクロ遠心チューブに適切な識別情報を記入します。それぞれのチューブに、適切な酵母培養液を1.5 millilitersずつ分注します。室温で5,000 Gs、2分間遠心分離します。

遠心分離後、マイクロピペットを用いて、ペレットを乱さないように注意しながら上清を慎重に除去し、廃棄します。手順を続行する前に、ペレットが十分に大きいことを確認してください。ペレットが小さすぎる場合は、ペレットが入っている同じチューブに培養液を1.5 milliliters加え、再度遠心分離して、より大きなペレットを得てください。

マイクロピペットを用いて上澄み液を廃棄し、酵母ペレットから可能な限り液体を取り除きます。次に、酵母ペレットに100 µLのSG緩衝液と30 µLのリアーゼ溶液を加え、ボルテックスで混合します。その後、両方のチューブを室温で30分間インキュベートします。

10分ごとに各チューブを静かに回旋させ、球状体を形成させます。酵母の球状体プレート作成において最も重要なステップの一つは、処理後に実際に100%の球状体が形成されたことを確認することです。つまり、すべての溶解酵素が同様の効果を持つわけではないということです。

したがって、リティック酵素（溶解酵素）が適切に作用し、良好なスフェロプレート（球状細胞の塗布）が得られているかを確認する必要があります。具体的には、これらのサンプルを顕微鏡スライドに載せ、0.1% SDSを添加して顕微鏡下で観察し、プロトプラストが形成されていることを確認します。完全なスフェロプレートを観察するには、酵母サンプル10 µLを顕微鏡スライドに分注し、0.1% SDS 1 µLを添加して酵母細胞を膨潤させ、完全な球状またはスフェロイド（球状体）を形成させてから顕微鏡で観察します。出芽細胞も同様にスフェロイドを形成することを確認することが重要です。

部分的なスフェロ（sphero）プレーティングが観察される場合は、リアーゼ（liase）による処理時間を延長することを推奨します。各チューブに350 µLのBRLTバッファーを加え、完全なスフェロプレーティングが確認されたら、100%エタノールを250 µL加えます。蓋をしっかりと押さえて密閉し、1分間激しくボルテックスしてください。

この手順では、Spheroプレートをライシスします。その後、Rおよびeasy Zスピンカラムを用いて、2つの培養物からRNAを回収し、精製します。最後に、抽出したRNAの品質を1.2%precast arosゲルの電気泳動で評価し、ビオチン標識CRNAを調製します。

酵母細胞から抽出した全RNAをまず用い、逆転写によりcDNAを合成します。cDNA生成後、cDNA沈殿に使用するPhase Lock Gelチューブを準備します。Phase Lock Gelチューブを最大速度で1分間遠心分離し、ゲルがチューブの底にあることを確認してください。Phase Lockチューブをボルテックスしないでください。cDNAを沈殿させるため、pH 8.0のTris緩衝フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（PCI）混合液の下層を162 µLピペットで採取し、第2鎖cDNA合成反応チューブの内容物162 µLに加えます。この工程では、水層と有機溶媒層を等量ずつ加える必要があります。

5秒間ボルテックスして内容物を混合します。次に、マイクロピペットを使用して、CD N-A-P-C-I混合液のすべてをフェーズロックゲルチューブに移します。フェーズロックゲルチューブをボルテックスせず、最大速度で2分間遠心分離します。

次に、マイクロピペットを使用して、フェーズロックゲルチューブの上層を、新しくラベルを貼った1.7 mLチューブに移します。この層を可能な限り多く回収するようにしてください。1.7 mLマイクロ遠心チューブに、100% ethanol 405 µL、酢酸アンモニウム 80 µL、およびペレットペイント 1 µLを加え、ボルテックスします。

チューブのヒンジ部分を外側に向けて遠心機にセットし、最大速度で20分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、室温で、CD NAペレットを乱さないように注意しながら、チューブをゆっくりと遠心機から取り出します。ペレットにはペレットペイントが使用されているためピンク色をしており、大きさは塩の粒ひとつ分程度になります。

ヒンジの下にあるチューブの側面にCD NAペレットを氷上に置き、直ちにペレットの洗浄操作に移ります。CD NAペレットの洗浄手順を開始するには、P 1000マイクロピペットを使用して、チューブから上清をすべて慎重に除去します。このとき、ペレットを乱さないように注意してください。

500 µLの冷えた80%エタノールをチューブの中のサンプルに加えます。チューブのキャップを軽く閉め、ゆっくりと数回転倒混和させます。ペレットがチューブの壁面から剥がれないよう、細心の注意を払って観察してください。

ペレットが剥がれた場合は、チューブをラックに戻してペレットが底に沈殿するまで待つか、最高速度で15秒間遠心分離することで、再びチューブの底に戻すことができます。次に、P 1000 マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないように注意しながらエタノールを除去します。チューブを傾けて、可能な限り多くの液体を取り除いてください。

冷やした80%エタノールを1 mL加え、チューブにキャップをしてゆっくりと数回転倒混和させます。P1000マイクロピペットを用いて、可能な限りすべてのエタノールを除去します。その後、チューブを最大速度で5秒間遠心分離します。

次に、P 10マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないようにして、最後の数µLのエタノールを除去します。チューブの蓋を開けたまま乾燥ボックスに10～20分間置き、残りのエタノールを蒸発させます。乾燥後のペレットは失われやすいため、チューブを慎重に扱い、キャップを閉めるように注意してください。

乾燥が完了したら、乾燥したペレットを確認し、チューブ内に存在することを確認します。最後に、乾燥したペレットを 22 µL の RNA free water で再懸濁し、チューブを氷上に置きます。この cDNA を用い、Enzo BioArray kit を用いた in vitro transcription により、ビオチン標識 cRNA を調製します。

ビオチン標識CRNAの精製と定量後、ターゲット調製のために断片化を行います。CDNAが生成された後、標準的なインビトロ転写法を用いてビオチン化CRNAを生成します。マイクロアレイチップに適用する前に、CRNAを断片化させる必要があります。

本手順を開始するには、5 µg相当のCRNAをラベル付きの0.5 mL PCRチューブに移します。全量を16 µLにするまでRNaseフリー水を加え、次に5xフラグメンテーションバッファーを4 µLチューブに加えます。チューブ内の全量は20 µLになります。

チューブをボルテックスし、10秒間遠心分離します。次に、チューブを94 °Cで30分間インキュベートします。サーモサイクラーでのインキュベート後、チューブを氷上に置きます。

次に、各サンプルの断片化および未断片化CRNAを、1.2% プレキャストAROSゲルを用いた電気泳動により評価します。泳動完了後、ゲルをトランスイルミネーターで可視化し、画像を撮影します。最終合成産物をatric酵母遺伝子チップにハイブリダイズさせ、マイクロアレイ解析による代表的な結果をここに示します。

この最初の図は、atrics遺伝子チップ動作ソフトウェアによって生成された、スキャン済みatrics酵母遺伝子チップ画像の例です。これは、コントロール群と処理群の酵母データを比較した、約6,700個の遺伝子を含むすべての遺伝子転写物の2D散布図です。各点は単一の遺伝子を表しています。

紫色の遺伝子は差発現しており、赤色の遺伝子は差発現していないことを示しています。この例では、説明文に示されている通り、差発現している遺伝子のほとんどが細胞周期制御に関与するものです。アノテーション可視化および統合的発見のためのデータベースから得られたこのフローチャートは、影響を受けた生物学的パスウェイにおける差発現遺伝子を示しています。

赤色の星印で示された遺伝子は、有糸分裂経路において発現が低下した遺伝子を示しています。最後に、geo species gene sifterソフトウェアを用いて作成したボルケーノプロットの代表的な結果をここに示します。コントロール群と処理群のサンプルを、P値のカットオフ値を0.05、発現変動のカットオフ値を1.5倍として比較しました。

酵母は迅速に培養しやすいため、本研究では酵母を選択しましたが、酵母を用いる際に最も重要なのは、適切にスフェロプラスト平板培養を行うことであると認識しました。マイクロアレイ解析において避けるべきことの一つは、不完全な消化を行い、G1期またはG2/M期にあるスフェロプラスト細胞のみを回収してしまうことです。そうなると、特定の複製相にある酵母を用いてマイクロアレイ実験を行うことになってしまいます。

この演習で強調したいもう一つの複雑な点は、日常的に話題に上がるCD NAのペレット化が、必ずしも簡単ではないということです。そこで本モジュールでは、特殊なチューブと可視化試薬を使用しました。これにより、実際にDNAを遠心分離してペレットを可視化できるため、学生にとっても指導者にとっても理解しやすくなっています。

これにより、開発後のDNAおよびRNAに関するあらゆる工程での活用が可能になります。本モジュールは、学士課程の教育機関の教員が、既存のカリキュラムや自身の研究関心に適合する他のモデル生物や治療法を模索するための道を切り拓きました。実際に行われた修正例を挙げると、ある施設では酵母に対する除草剤処理の影響を検討し、別の施設では酵母におけるLAMP IDE処理を検討し、また別の施設では特に関心のあった哺乳類細胞株における発生上の変化を検討しました。

最後に、別のサイトでは、異なる光源がシロイヌナズナなどの植物に与える影響について検討していました。このビデオを視聴することで、酵母からの全RNAの単離、cDNAの合成、およびビオチン標識cRNAの断片化を含む、学部生向けのマイクロアレイ実験のセットアップ方法について十分に理解できるはずです。このような高度な技術を実際に体験することは、学部レベルの科学教育を補完し、強化することに役立ちます。