集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

この手順の目的は、集束イオンビーム（FIB）および走査電子顕微鏡（SEM）を用いて、脳組織の特定領域から連続画像を取得することです。まず、脳をスライスし、染色後に樹脂埋込を行います。次に、埋込後の脳切片から関心領域を切り出し、未記入の樹脂ブロックにマウントします。

第3のステップは、ウルトラミクロトームで樹脂ブロックをトリミングし、顕微鏡のイオンビームを用いてイメージングを行う領域のみを切り出すことです。最終ステップでは、各画像の撮影前にイオンビームで薄い層を繰り返し除去し、樹脂ブロックの一面を連続的にイメージングします。最終的に、関心領域を貫く連続画像の結果を得ることができます。

画像シリーズは自動的に収集され、データセットは通常等方性ボクセルを持つため、スタック内の画像構造をあらゆる角度から観察することができます。この手法の既存の手法（連続切片透過電子顕微鏡法など）に対する主な利点は、はるかに高いZ方向の分解能を達成できることです。また、電子トモグラフィーと比較して、樹脂埋め込み試料において最適な分解能でより大きな体積を画像化することが可能です。

まず、麻酔下で灌流固定したラットから脳を摘出します。温めた5% aerosをプラスチック製のモールドに満たして脳を埋め込み、aerosが凝固する前に脳を適切な角度に調整します。脳を含むaerosブロックをビブラトームのサンプルホルダーに固定します。冠状面に沿って80 micronの厚さで切片を作成し、目的の領域が含まれるまで必要な枚数の切片を採取します。

次に、サンプルを20 mLのガラス製絶縁バイアルに入れます。1つのバイアルあたり最大10セクションまで入れます。0.1 M K coate緩衝液で、5分間を1回として3回サンプルを洗浄します。

次に、0.1 M K coate緩衝液中の1.5%シアン化カリウムおよび1%四酸化オスミウムで、サンプルを30分間染色します。続いて、0.1 M K coate緩衝液中の1%四酸化オスミウムで、さらに30分間サンプルの染色を継続します。その後、二重蒸留水で3分間、1回洗浄し、二重蒸留水中の1%al acetateで30分間染色します。

次に、切片を2回蒸留水で5分間洗浄し、その後、段階的なアルコール系列で脱水します。この際、液を交換するたびに2分間置きます。次のステップは、アルコールと混合した濃度の異なるDuran樹脂に切片を包埋することです。各段階で30分間置きます。まずエタノールと樹脂の比率を50:50から開始し、次に30:70、続いて10:90とし、最後に100%樹脂に30分間浸漬させます。

その後、培地を100%新鮮なduran resinに交換します。ローラーミキサーを用いて1時間、ゆっくりと撹拌します。包埋後、木製コクテルスティックを使用して、あらかじめ型離し剤をコーティングしたガラス顕微鏡スライドに切片を配置します。

スライドに可能な限り多くの切片を載せますが、詰め込みすぎないように注意してください。また、顕微鏡スライドの間には識別ラベルを必ず配置してください。スライドを65 °Cのオーブンに24時間置いてください。

翌日、オーブンからサンプルを取り出します。カミソリの刃をガラス顕微鏡スライドの間に慎重に差し込み、指で樹脂層を保持しながら、サンプルを含む樹脂層をスライド間から取り出します。流水でサンプルを静かに洗浄してください。

金型離型剤を除去するために、透過照明を備えた実体顕微鏡の下にサンプルを置き、低倍率対物レンズで観察します。微細な針を用いて、関心領域に印を付けます。カミソリの刃を使用し、関心領域の周囲を3 mm × 3 mmの小さな正方形に切り出します。

アクリル接着剤を使用して、小さな樹脂ブロックをブランク樹脂ブロックの上部に貼り付けます。次に、ブロックをウルトラミクロトームのホルダーに固定します。装着された実体顕微鏡で観察しながら、カミソリを用いて、関心領域のみが小さなピラミッド状に残るまで周囲をトリミングします。

ウルトラミクロトームに固定したガラスナイフを用い、ブロックの上面に対して角度をつけて、目的領域に近いエッジ部分を切断します。さらにブロックをトリミングし、ブロック表面の寸法に対して目的領域を正確に位置決めできるようにします。ブロックをウルトラミクロトームから取り外し、透過光顕微鏡下に設置します。

関心領域を撮影します。ジュエリーソーを使用して、トリミングしたブロックをカーボンペイントを塗布した残りの樹脂スタブから切り離します。切り出したSAブロックをSEMサンプルホルダーに固定し、撮影面が最も外側の端を向くように配置します。

接着剤が乾燥した後、試料をクリスチャン・バキューム蒸着装置（crescent and vacuum evaporation system）に移し、ブロックに20 nanometers以上の金薄層をコーティングします。これで、樹脂包埋された組織ブロックを集束イオンビーム走査型電子顕微鏡（FIB-SEM）で観察する準備が整いました。試料ホルダーに入ったサンプルを低倍率で顕微鏡に導入し、二次電子像を用いて、関心領域と観察面が正面を向くようにブロックを方向付けます。

オペレーターは、イメージングする面がミリングビームに平行になるようにブロックを配向させます。これにより、イオンビーム電流 13～27 nano amps、加速電圧 30 kilovolts の条件下で、電子ビームがこの面に対して54度の角度で配向されます。

イメージングを行う領域の前方から、樹脂の狭い帯状の部分を除去します。次に、後方散乱電子イメージングモードに切り替え、関心領域の上にある切削面を確認します。先に撮影した光学顕微鏡のリファレンス画像と切削面の画像を用いて、顕微鏡のガス注入システムにより切削およびイメージングを行うブロック上の正確な領域を特定します。

700 picoampsの電流を用いて、関心領域の上のブロック表面に、厚さ約1ミクロンのカーボンまたは金属の保護層を堆積させます。最後に、最終的な画像を取得するブロック領域をミリングします。表面にミリングによるアーティファクトが見えなくなるまで、ミリングビームでこの画像面を完全にミリングしてください。

顔面の連続撮像のための顕微鏡パラメータを選択します。一般的なパラメータは、電圧が1.2から2 kV、ピクセルサイズが4から20 nmの間です。顔面のミリングと1枚の画像取得にかかる合計時間が2分以下になるよう、ピクセル滞在時間は約10 µsに設定してください。

熱的な変化を安定させるため、顕微鏡を少なくとも2時間静置します。その後、ミリングおよびイメージングプロセスを開始し、関心領域の連続画像を取得します。この図は、ラップブレイン領域内の超微細構造を示すブロックフェイスの逆コントラスト反射電子像です。

すべての膜に加えて、巨大な高分子構造も可視化されています。この図は、5 nmの間隔で収集された計1,600枚の画像で構成されており、等方性ボクセルを持つ画像スタックとなっています。このスタックを用いることで、どの平面においても同一の解像度で撮像することが可能です。

このビデオを視聴することで、集束イオンビーム走査電子顕微鏡を用いた連続イメージングのために、どのように脳組織を調製するかについて十分に理解できたはずです。