ヒト神経幹細胞を数える
2007年8月22日
生存細胞の正確な数の知識は、多くの組織培養の操作が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、血球計算盤を用いて細胞を定量化する方法について説明します。それはヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明していますが、それは他の細胞型に使用することができます。
ここでは、ヒト神経前駆細胞の計数方法について説明します。細胞を免疫化学染色の段階に移行させる際や、核因子機序を用いたトランスフェクションを行う際に計数を行います。ここでは、エッジグリッドを備えた位相差ヘモサイトメーターと、トリパンブルーという染料を使用します。この染料は、生存細胞と死細胞を区別できるため非常に有用です。
死細胞または死にゆく細胞はこの染料を取り込み、青色に染まります。ヘモサイトメーターで細胞を観察すると、生存細胞はこの染料を排除できるため、青色には染まりません。これにより、細胞の生存率を決定できます。トリパンブルーと培地の混合溶液を調製します。
この0.5 mLのエピチューブに、20 µLのトリパンブルー溶液を加えます。次に、25 µLの培地を加えます。これにより、現在はトリパンブルーと培地の混合液が45 µLあり、ここに5 µLの細胞懸濁液を加えることで、10倍希釈（1:10希釈）となります。
それでは、5 µLの細胞懸濁液を添加します。まず、フィンガーボルテックスを用いて細胞が十分に再懸濁されているか確認します。この溶液がよく混合されていることを確認してください。
そこで、ベッドを数回上下させます。最後に、この細胞懸濁液を約 12 µL、血球計数器に注入します。これには2つのポートがあり、どちらを使用しても構いません。
したがって、このポートから溶液を導入するだけで、毛細管現象によって液体が吸い上げられます。これでカウントの準備が整いました。10倍の倍率でヘモサイトメーターを確認します。ここには16個の正方形を含む区画があります。
ご覧の通り、ここでは生存細胞と死細胞を観察することができます。こちらにある、これやこれ、そしてこれらが生存細胞です。また、こちらの細胞のように、いくつかの死細胞も見られます。
お気づきの通り、死細胞は濃い青色に見えますが、生細胞の周囲にはハロー（光輪）のようなものが見えます。それでは、ここからすべての生細胞をカウントします。左から右へ、そして上から下へと数えていきます。
1、2、3、4、5、6、33、1 32、33、34、3 5、3 6。したがって、この象限には合計で36個の細胞があります。この線のような象限の境界線上にある細胞がある場合、一貫性を保つため、左側の境界および上側の境界にある細胞をカウントします。
そして、ヘモサイトメーターのすべての区画において、境界線上の細胞を一貫してカウントします。それでは、1 µLあたりの細胞数を算出します。そのために、1区画あたりの細胞数の平均値である38に、チャンバーの寸法によって決定される係数である10を掛けます。
さらに、今回の希釈倍率である10を掛けます。最終的に、1 µLあたりの細胞数が得られます。したがって、この場合は 3,800 cells/µL となります。
また、細胞ペレットを500 µLの溶液で再懸濁させたため、全細胞数を算出することができます。これで準備が整いました。
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概要
本プロトコルでは、ヘモサイトメーターを用いてヒト神経幹細胞/前駆細胞（hNSPCs）を計数する方法について概説します。ここでは、さまざまな組織培養への応用において、生細胞と死細胞を区別することの重要性を強調しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 組織培養
背景
- 生存細胞数の測定は、組織培養の操作において極めて重要です。
- 生存細胞は特定の染料を排除できますが、死細胞は排除できません。
- 血球計数器は、細胞計数のための標準的なツールです。
- 細胞生存率の評価には、一般的にトリパンブルー染料が用いられます。
研究目的
- hNSPCsを計測するための信頼性の高い手法を提供すること。
- 生細胞と死細胞を効果的に区別すること。
- 免疫化学染色やトランスフェクションなどのさらなる実験に向けた準備を支援すること。
使用した手法
- 位相差ヘモサイトメーターの使用。
- 細胞生存率を判別するためのトリパンブルー染色の適用。
- 顕微鏡下での細胞カウント。
- トリパンブルーと培地の混合溶液の調製。
主な結果
- 生存細胞と死細胞の正常な分別の完了。
- hNSPCsの正確な定量。
- トリパンブルー染色の有効性の実証。
- 信頼性の高い計数法としての血球計数器の検証。
結論
- 本プロトコールは、細胞計数に対する簡便なアプローチを提供します。
- hNSPCs以外のさまざまな細胞種にも適用可能です。
- 細胞生存率を把握することは、組織培養実験を成功させるために不可欠です。
よくある質問
産業界における意義
生存しているヒト神経幹細胞/前駆細胞（hNSPCs）の正確な定量は、神経科学における創薬の再現可能な組織培養ワークフローに不可欠です。本プロトコルでは、信頼性の高い細胞生存率の評価と濃度測定を可能にし、免疫細胞化学やトランスフェクションなどの下流アプリケーションに向けた一貫した実験的な播種をサポートします。トリパンブルーを用いた生死判定と血球計数盤による計数を標準化することで、本手法は初期段階のターゲット検証およびアッセイ開発パイプラインにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ製薬研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： ターゲットエンゲージメントおよび経路調節研究において、hNSPCの精密な播種を可能にする。
- 運用の価値： 生存細胞の一貫した投入を保証することで、細胞ベースのアッセイにおけるばらつきを低減する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： アッセイの標準化に不可欠な、定量的で再現性のある細胞濃度データを提供します。
- 実用的価値： ハイコンテンツスクリーニング形式に適した、拡張性のある細胞懸濁液の調製をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 探索段階から前臨床段階への移行において、細胞入力の整合性を維持します。
- 運用の価値： 標準化された細胞計数手順を通じて、部門横断的な連携を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は初期創薬のプロセスに適合しており、ターゲットのバリデーションからアッセイの最適化、さらには前臨床での有効性試験に至るまで、信頼性の高い細胞調製を可能にします。
- 探索生物学：hNSPCを用いたターゲット検証実験において、正確な細胞投与量を確保します。
- スクリーニング：再現性のあるアッセイ性能に必要な、標準化され定量化可能な細胞入力を提供します。
- 分析：実験条件を正規化するために使用される、生存細胞濃度および総細胞数の出力を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの探索から前臨床モデルに至るまでの、細胞ハンドリングの連続性をサポートします。
- 組織内での再利用：複数の細胞種やプロジェクトに適用可能な、転用可能で低複雑度な能力を提示します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞ベースの実験入力における変動を最小限に抑えることで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：研究室やチーム間での再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値：信頼性の高いアッセイ基盤を通じて、より適切なゴー/ノーゴー判断を支援します。
- ポートフォリオへの影響：初期の有効性スクリーニングにおけるデータ品質を確保することで、リスク調整済みの開発推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 基本的な組織培養技術および顕微鏡操作の習熟が必要です。
- ヘモサイトメーターの利用可能性と、汚染を防ぐための適切な洗浄に依存します。
- 偏りのない区画選択および境界線のカウントルールの徹底のため、一貫したオペレーター研修が必要です。
- 手動カウントの処理量に制限があるため、調整なしではハイスループットな自動化には適していません。
- 細胞懸濁液の代表的なサンプリングを確保するため、正確な希釈と混合に依存します。
