ヒト神経幹細胞を継代

こんにちは、スティーブです。カリフォルニア大学アーバイン校病理学部のFlanagan博士の研究室に所属しています。本日は、ヒト神経前駆細胞の継代方法（スプリット）について説明します。

この手法では、まず新しいフラスコをヒトフィブロネクチン溶液でコーティングし、細胞解離バッファーを用いて細胞を剥離させます。次に、10%血清溶液で細胞解離バッファーを中和し、細胞懸濁液を遠心分離した後、新鮮な培地で細胞を再懸濁させ、その細胞懸濁液を新しいフラスコに移します。当研究室では、ヒト神経前駆細胞の培地を1日おきに半分交換して培養し、1対2に分散させて約1週間に1回継代しています。細胞を継代する際、免疫化学実験に使用する場合や、核エフェクターを用いてトランスフェクションを行う場合は、細胞数をカウントすることがあります。

細胞を回収する際は、細胞解離バッファーを使用することが重要です。なぜなら、トリプシンとは異なり非酵素的であり、細胞への負荷が格段に少ないためです。現在、組織培養室にいます。コンフルエントになったヒト前駆細胞のフラスコの様子をお見せする前に、まず組織培養の準備を行います。まず、UVライトを消し、照明とエアフローをオンにします。

次に、ペーパータオルに70% ethanolをスプレーしてフード内を拭き上げ、フードを消毒します。70% ethanolをフード内に直接スプレーすると、非常に高価なHEPAフィルターを損傷させる可能性があるため、必ずペーパータオルにスプレーして使用することが重要です。続いて、すべての試薬と器具にスプレーを行います。

最後に、真空ホースをスプレーすれば準備完了です。それでは、これらの細胞を確認しましょう。これらの細胞は、コンフルエンシーが約80%の状態に見えます。

これらはヒト胎児から単離されたヒト神経前駆細胞であり、T 25フラスコで培養しています。1週間に1回から2回の頻度で継代（分割）を行います。それでは、細胞の継代準備を始めます。

まず、BD biosciences社製のヒトフィブロネクチンで4時間コーティングした新しいT 25フラスコを用意します。フィブロネクチン溶液を除去した後、細胞をフラスコに移す前に、このフラスコをBBSで洗浄します。

それでは、37°Cのインキュベーターから細胞を取り出します。こちらです。次に、ヒトフィブロネクチンでコーティングした新しいフラスコから、PBS洗浄液を除去します。

そして、2 mLの古い調整培地を新しいフラスコに加えます。次に、細胞を表面から回収する前に、PBSで洗浄する必要があります。まず、残っている培地を除去し、細胞が乾燥しないよう、すぐに約2 mLのPBSを加えます。

PBSを除去し、フラスコの表面から細胞を剥離させるために細胞解離バッファーを加えるまで、約2分間待ちます。それでは、PBSを除去します。細胞が乾燥しないよう、すぐに細胞解離バッファーを加えます。細胞解離バッファーを1.5 mL加えます。

PBSとは異なり、これを細胞に直接添加し、可能な限り広い面積をカバーするようにします。そのため、バッファーをゆっくりと細胞に添加しながら、フラスコを左右に動かします。そして、細胞が表面から剥がれ始めるまで、約5分間待ちます。

そして、フラスコをフード内の室温に置いておきます。ここで見てわかるように、細胞がまず円形になり始め、その後、表面から剥がれ始めます。実際、すでにいくつかの細胞が浮遊しているのが見えます。フラスコの側面を軽く叩くと、細胞の剥離を促進させることができます。

5分が経過しました。ご覧の通り、表面から剥離した細胞によって溶液が非常に濃くなっています。ここで、4.5 mLの血清含有培地を加えて、細胞解離バッファーの効果を中和します。10%熱不活化胎児牛血清を含むDMEM/F12培地を用い、細胞の脱離漏れがないよう、フラスコの表面に直接添加します。

次に、ピペッティングをゆっくりと行い、残っている細胞をすべて剥がします。その後、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、1,000 RPMで1分間遠心分離します。

細胞の遠心分離が完了し、ここに良好な細胞ペレットが得られました。ペレットを乱さないよう、非常に慎重に血清含有培地を除去します。その後、4 mLの培地でペレットを再懸濁します。

次に、細胞の凝集塊が残らず溶液が均質になるまで、ペレットを再懸濁させます。今回は1:2で継代するため、4 mLのうち2 mLを、あらかじめ2 mLの条件培地が入っている新しいフラスコに移します。最後に、フラスコに細胞種、継代数、および日付を記載します。

これは30分前に継代した細胞の様子です。見ての通り、ほとんどの細胞が表面に接着し、突起を伸ばし始めています。以上で終了です。

それでは、計数を行います。