ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

本実験の全体的な目的は、長距離の相互作用を持つDNAパートナーを探索し、同定することである。まず、固定化、細胞溶解、および1番目の制限酵素によるDNA消化を行い、続いてライゲーションを行うことで、相互作用する2つの遺伝子由来のセグメントから構成されるキメラDNAを作成する。次に、2番目の制限酵素消化の後、キメラDNAにリンカーを付加する。増幅を容易にするため、リンカーおよびベイトDNA特異的プライマーを用いてPCR増幅を行い、相互作用するDNA断片を十分な量で回収する。得られた増幅DNA断片の配列解析に基づき、ベイトDNAと長距離の相互作用を持つDNAパートナーを特定する。

クロームソン確認キャプチャ（3C）などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、A-C-T-S-Aを用いて未知の長距離共役DNAパートナーを効果的に同定できる点にあります。対して3Cは、以前から疑われていた相互作用の検証のみを目的として開発されました。本プロトコルの開始にあたり、ヒト細胞を37 °C、5% CO₂環境下のインキュベーターで、コンフルエンスが80～90%になるまで培養します。

このデモンストレーションでは、ヒト前骨髄球性急性白血病細胞を使用します。細胞を50 milliliterのNOCチューブに注いで回収し、1200 RPMで15分間遠心分離します。遠心分離後、培地を吸引して除去します。

5 mLの培地を加えて、細胞ペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターで細胞数を計測した後、約1×10⁷個の細胞を、10% FBS含有RPMI 1640培地を用いて40 mLに希釈します。次に、1.7 mLの37% ホルムアルデヒドを加えて、希釈したクロマチンを固定します。

サンプルを室温で10分間、緩やかに振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、2 Mのグリシン2.4 mLを加えて反応を停止させます。次に、サンプルを1200 RPM、4 °Cで15分間遠心分離します。

上清を除去した後、ペレットを40 mLの氷冷PBSで1回洗浄し、遠心分離して洗浄後の細胞ペレットを回収します。得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤と0.1 mM PMSFを添加したばかりの40 mLの氷冷ライシスバッファーに再懸濁し、コールドルームで回転混和させながら90分間インキュベートします。最後に、サンプルを2,500 RPMで15分間遠心分離し、上清を除去して単離した核を得ます。核を0.5 mLの1X NEB Buffer 3に再懸濁し、15 µLの10% SDSを添加します。

サンプルを37 °Cで1時間振盪しながらインキュベートします。次に、SDSを捕捉するために20% Triton X 100を45 µL加え、再び37 °Cで1時間振盪しながらインキュベートし、1 × 10⁶個ずつ分注します。制限酵素消化には、核溶液55 µLあたり約15 µgの核を使用します。

1X NEB buffer 3を433 µL、BGL IIを12 µL加えます。総消化反応液量を500 µLとし、反応液を37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、10% SDSを95 µL加えて制限酵素を不活化し、65 °Cで20分間加熱して酵素を変性させます。

ウォーターバス内で、1xライゲーションバッファー 7 mLと20% Triton X 100を 360 µL加えます。サンプルを37 °Cで1時間インキュベートします。温度を16 °Cに下げ、400 units/µLを 50 µL加えます。

T4 DNAリガーゼを加え、ライゲーション反応を16 °Cで4時間、その後室温で30分間インキュベートします。ライゲーション完了後、300 µgのプロテイナーゼKを加え、65 °Cで一晩インキュベートします。

次に5 µgのRNAAを加え、37 °Cで30分間インキュベートします。フェノール・クロロホルム抽出によってDNAを精製し、イソプロパノールでDNAを沈殿させ、沈殿したDNAを150 µLの滅菌蒸留水に溶解させます。キメラDNAにリンカーを付加するために、まず2 µgの精製DNAを5 unitsのMspIとともに37 °Cで4〜6時間インキュベートしてDNAを消化します。消化後、65 °Cで10分間加熱し、MspIを不活性化させます。

次に、5 mg/mL のグリコーゲンを 1 µL 加えて、エタノールで DNA を沈殿させます。得られた DNA ペレットを 50 µL の滅菌蒸留水に溶解させます。続いて、MSP1 処理済みの DNA 50 µL に、20 µM のリンカーオリゴヌクレオチド L を 2 µL と 20 µM のオリゴヌクレオチド S を 1 µL 混ぜ合わせ、さらに滅菌蒸留水 1 µL と 10X T4 DNA Ligase buffer 6 µL を加えます。

混合液を液体ワックスで覆います。オリゴヌクレオチドを50 °Cで1分間加熱して変性させ、1分間に0.5 °Cの勾配で10 °Cまで徐々に冷却します。サーマルサイクラーを用いて、400 units/µLのT4 DNAリガーゼを1 µL加え、反応液を15 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、Kaya Quick PCR精製キットを用いてリンカーライゲーション後のDNAを精製し、50 µLの滅菌蒸留水で溶出させます。次に、長距離相互作用を調査するDNAの特定領域に対するプライマーを選択します。この例では、Abelをプライマー（ベイト）として使用します。

精製DNA 1 µLに、20 µM の able 1 特異的プライマー（46 56）1 µLと、20 µM のリンカー特異的プライマー（29 63）1 µLを合わせて、第1ラウンドPCR用の精製DNAを準備します。次に、書面プロトコルに従って 32 P-D-C-T-P をあらかじめ混合した 3x ClinTech DNAポリメラーゼIカクテル 3 µLを加え、続いて滅菌蒸留水 3 µLを加えます。PCRサイクル完了後、書面プロトコルに記載されているホットスタートPCRサーマルサイクルを用いてPCR増幅を行います。

kaya quick PCR purification kitを用いて、1回目のPCR産物を精製します。滅菌蒸留水30 µLで溶出してください。100倍に希釈した1回目のPCR産物を1 µL用い、20 µMのable 1特異的プライマー（46 26）1 µLと、20 µMのリンカー特異的プライマー（29 61）1 µLを添加して、ネステッドプライマーによる2回目のPCRを行います。

さらに、3 µLの3x ClinTech DNA polymerase ワンコックテールと3 µLの滅菌蒸留水を加えます。95 °Cで20秒、67 °Cで40秒、72 °Cで1分間のサイクルを25回繰り返すサーマルサイクリングスケジュールを用いて、2回目のPCRを実施し、最後に72 °Cで5分間の伸長反応を行います。

5% ureaページゲルを泳動し、露光後のスクリーンをフォスフォイメージャーでスキャンして、PCR産物を視覚化します。各PCRバンドは、ゲルストリップを60 µLの滅菌蒸留水を含むエッペンチューブに溶解し、95 °Cで5分間インキュベートすることでゲルから回収できます。溶解したゲル産物を10,000 RPMで10秒間、短時間遠心分離します。

すべてのサンプルを回収します。プライマー修復を伴うPCRに使用するDNAテンプレートとして、1 µLを分注します。29 61 46 26。

上述した条件を用いて精製後、オンラインツールを用いてシーケンス解析を行い、染色体上の位置を決定することができます。ゲノムバイオインフォマティクスのサイトにアクセスし、「blatt」をクリックして新しいウィンドウを開き、DNA配列をペーストします。DNA配列を送信すると、BLATTの検索結果が表示されます。

100%の一致を示すヒット箇所でブラウザをクリックし、DNA配列の位置を確認します。long-range DNA相互作用を決定するため、able one領域をベイトとして使用しました。ACTアッセイのために、2箇所のBgl IIサイトと1箇所のBam HIサイトを選択しました。2回目のPCRプライマーセットにおいて、46 26 29 61を用いてable M1を、46 30 29 61を用いてable M2を、そして46 36 29 61を用いてable M3を増幅しました。

一般的なゲルパターンでは、ここに示すable M1、able M2、およびable M3のように、1つまたは数本のバンドが現れます。クローンable M1のDNA配列を以下に示し、ACTアッセイによる各断片が、2つの結合したDNAセグメントで構成されていることを証明します。一方のセグメントはベイトDNA領域に由来し、もう一方は関連するパートナーに由来します。

各セグメントは、1番目の制限酵素認識配列によって互いに結合されています。2番目の酵素認識 sequence は、関連するパートナー配列の末端に現れます。クローニング可能な M1 フラグメントには、染色体 9q32.4 に位置する ABLE1 の領域からの DNA が含まれており、関連するパートナーは proc2 として同定された染色体 3p3 に位置しています。

同様に、able M twoの関連パートナーは染色体5番のQ 21.1に局在していましたが、クローンable M threeは、3Cアッセイとは対照的に、ABLE one遺伝子座付近の染色体内会合として同定されました。このビデオで概説する手法では、最も一般的である長距離相互作用が選択されます。しかし、PCRのサイクル数を増やすことで、より頻度の低い追加の会合を同定することも可能です。マウス線維芽細胞におけるIGF two H 19遺伝子座のインプリンティング制御領域（ICR）をベイトDNAとして使用し、ACTアッセイの第1ラウンドと第2ラウンドのPCRで異なるサイクリングプログラムを適用しました。

A CTアッセイは、正常細胞とがん細胞の間における核構造および長距離相互作用の差異を特定するためにも利用できます。正常な結腸組織と結腸がん組織をホモジナイズし、本稿に記載の手順に従ってA CTアッセイを実施しました。ここでは、IGF2/H19遺伝子座におけるICR領域およびIGF2遺伝子のDNA構造を示しています。

A CTアッセイの2つの部位について、2回目PCRで使用される標識プライマーを、色分けされた矢印と番号で示しています。A CTアッセイのゲルパターンは、プライマー29 61を、プライマーペア 41, 61、41 63、51 45、および51 51のいずれかと組み合わせて使用したPCRの結果を示しています。正常大腸組織のみに現れる特有のバンドを黄色の矢印で、開発後に大腸がん組織のみに現れたバンドを赤色の矢印で示しています。

この手法は、マルケット生物学分野の研究者が、核構造と遺伝子調節を三次元的に探索するための道を切り開くものです。