自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング

本手順の目的は、高圧染色体標本作製法を用いて蚊のポリテン染色体を作成し、それに続いて自動蛍光in situハイブリダイゼーションおよび自動イメージングを行うことで、DNAプローブをポリテン染色体にマッピングすることです。まず、高圧法を用いてポリテン染色体のスプレッドを調製します。次に、ニックトランスレーションプロトコルを用いてゲノムDNAを蛍光色素で標識し、蛍光プローブを調製します。

3番目のステップでは、自動スライド染色システムを用いて蛍光in situハイブリダイゼーションを行います。最終ステップでは、自動蛍光イメージングシステムを用いて、ラベル化された染色体をスキャンし、撮影します。最終的に、画像によってポリ染色体上の蛍光ラベル化DNAプローブの局在を示すことができます。

本手法の標準的な手動in situハイブリダイゼーションプロトコールなどの既存手法に対する主な利点は、この高スループットな物理マッピングプロトコールによって、より一貫した結果が得られ、手作業の時間が大幅に削減されることです。本プロトコールでは、まず、吸血後約25時間の雌を解剖し、卵巣がstage 3にある状態で回収します。この段階では、卵胞内の栄養細胞を含む透明な領域が円形であるはずです。5匹の雌から卵巣を回収し、500 µLの調製直後の修正Carnoy液で固定します。

その後、室温で最大24時間まで、あるいは-20°Cでより長期間保存できます。次に、卵巣の解剖スライドを作成する直前に、カルノ溶液と50%プロピオン酸を準備します。解剖顕微鏡下で、埃のないスライド上の新鮮なカルノ溶液の一滴に、各ペアの卵巣を配置します。

解剖針を用いて卵巣を分割します。卵巣の断片すべてを、50% 酢酸プロピオンが含まれる6枚の清潔なスライドガラスに移します。解剖針を用いて、卵胞を互いに分離します。

その後、残っている組織をペーパータオルで拭き取ります。50% propionic acidをもう1滴加え、3～5分間待ちます。注：毛包を50% propionic acidに3～5分間浸すと、染色体の伸展が大幅に改善されます。

次に、カバーガラスを掛け、核が広がるまでさらに1分間待ちます。スライドをフィルターペーパーとプラスチックで包みます。ドレメルを3,000〜5,000 RPMに設定し、約1分間、回転するドレメルのチップでカバーガラスを軽く円を描くように動かします。

位相差顕微鏡で展展状態を確認し、染色体を平坦にするために必要に応じてドレメルを長く適用します。1枚目のカバーガラスに隣接して2枚目のカバーガラスを配置し、別の顕微鏡スライドでカバーガラスを挟みます。次に、スライドをプラスチックシートとフィルターペーパーで包み、バイスに固定して、85から120 inch poundsの間でスライドを圧搾します。

6枚すべてのスライド上の染色体を平坦化した後、スライドのラップを外し、染色体をさらに平坦にするために余分なスライドを取り除きます。スライド変性ハイブリダイゼーションシステムを用い、55 °Cで10〜15分間スライドをインキュベートします。次に、スライドを液体窒素に少なくとも15秒間、または気泡が出なくなるまで浸します。

次に、カバースリップをカミソリで素早く取り除き、直ちにスライドを冷えた50%ethanolに5分間浸します。この工程を各スライドに対して順次繰り返します。その後、70%、90%、および100%ethanolの浴でスライドを脱水します。

それぞれの浴槽に5分間浸します。最後に、スライドを自然乾燥させれば、染色準備が完了します。プローブの標識化以外の手順の大部分は、自動装置によって行われます。

デバイスをロードする前に、市販のNICトランスレーションプロトコルに従って、バックDNAを蛍光色素で標識し、蛍光プローブを調製します。プローブの準備が整ったら、スライドと試薬を自動スライド染色システムにロードし、システムに以下の手順を実行するようプログラムします。まず、800 µLの1×PBSを20分間供給します。

次に、スライドをブロードライします。3番目に、1 XPBSで調製した4% formalin 450 µLを用いて、スライドを1分間固定します。その後、100% ethanolで1秒間の洗浄を2回行い、最後に2分間洗浄します。

エタノール浴の後、スライドを再度エアブローで乾燥させます。次に、気泡の発生を防ぐため、スライドを45 °Cで2分間加熱します。その後、DNAプローブを20 µL滴下し、続いてミネラルオイルを1滴滴下してカバーガラスをかけ、90 °Cで10分間、染色体を加熱します。

次に、スライドを42 °Cで14時間ハイブリダイゼーションさせます。ハイブリダイゼーション後、42 °Cで2分間ストリンジェンシー洗浄を行い、続いて2 XSSCを1秒間4回連続で塗布し、乾燥させます。その後、42 °Cで0.4 XSSCを800 µL、10分間2回塗布し、さらに1回洗浄を行い、最後に25 °Cで2 XSSCを10分間塗布します。

次に、染料として50 µLのYO-YO-1を添加し、続いてミネラルオイルを加え、カバーガラスを掛けます。スライドを25 °Cで10分間インキュベートします。その後、カバーガラスを取り除きます。

スライドを2x SSCで1回1秒間、計4回洗浄し、エアダスターで乾燥させます。最後に、各スライドにProlong Gold抗退色剤を15 µL滴下し、新しいカバーガラスを被せます。Accord Plus自動スキャンシステムを起動させますが、まずハロゲンランプ用のOlympus U-R-F-L-T電源から入れてください。

次にコンピュータを、最後にカメラアタッチメント付きの顕微鏡の電源を入れます。まずduetソフトウェアパッケージを開き、10倍のプレスキャンを設定します。オンラインボタンをクリックし、新しいケースIDを入力して、スライドIDを割り当てます。

bfと表記されたドットをクリックしてください。これが明視野（brightfield）オプションです。スキャン選択で10 x pre-scanを選択してください。

2,500 x circle、10,000 x circle、またはrectangleのいずれかを選択します。setをクリックしてrunを実行してください。その後、プロンプトに従ってスキャンを適切に調整し、finishをクリックします。

スキャンを開始するには、メインタブを押してメイン画面に戻ります。次に、オフラインボタンをクリックし、割り当てられたケースIDとスライドIDを確認して、「オフライン」をクリックします。

左上領域にあるブラックボックスをスキャンします。矢印をクリックし、「10 x pre-scan」を選択してください。関心のある画像が見つかった後、矢印を使用してスキャンした画像を確認します。

対象領域の中央にある画面をダブルクリックし、snapを押します。これにより、すべてのターゲットを選択した後にキャプチャする画像が指定されます。各画像を右クリックし、classifyをクリックして10 x pre-scanを選択し、polytanを選択します。

メインメニューに戻り、40xのプレスキャンを設定します。再度「online」を選択し、スライドを選択してください。BFをfflに変更し、タスク名を「revisit-X-40-rg」に変更します。

最後のsettingの直下にあるセクションをrevisit dash allに変更します。その後、プログラムを実行し、プロンプトに従ってください。オートメーションを設定するには、[start matching views]ボタンをクリックして、10xと40xの画像をマッチングさせます。

「完了」をクリックしてスキャンを開始します。完了後、「分類」をクリックして画像を確認してください。異常個体のガンビア雌個体から、高圧法を用いて卵巣栄養細胞の多価染色体を調製しました。

この手法では、大部分の染色体構造を損傷したり変化させたりすることはありません。曲がった染色体を平坦化することで、通常の標本では観察できない隠れた微細帯（ファインバンド）を明らかにします。染色体には、S Gambia および Tam back ライブラリの異常個体から得られたバック DNA クローンを用いてプローブハイブリダイゼーションを行いました。

このライブラリは、S Gambia害虫株の第1 instar 幼虫のオスおよびメスから作製されました。この手順に従うことで、自動化されたハイスループットな物理地図作成が可能となり、染色体ベースのゲノムアセンブリの迅速な構築が促進されます。