イメージング C.エレガンス胚

本プロトコルでは、汎用的な顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いて、Norky DIC光学系または蛍光観察により、C. elegans初期胚におけるダイナミックなイベントをイメージングする方法を実演します。まず、C. elegans胚の解剖およびイメージングのためのマウント方法について説明します。次に、最高精細で最適な画像を得るために、DICおよびNorky光学系の適切なセットアップについて解説します。

オープンソースソフトウェアと組み合わせて高品質な蛍光画像データを収集するための、広視野エピ蛍光および照明のキャリブレーションについても検討します。優れた顕微鏡観察により、発生中の胚における細胞ダイナミクスを可視化することが可能です。光学系の適切なセットアップは、用語が紛らわしく、適切な手法を文章のみで説明することが困難であるため、本手法の視覚的な解説が不可欠となります。

さらに、蛍光イメージングを行う際は、光への曝露を最小限に抑えるよう注意する必要があります。光毒性と光退色を制限するため、イメージング用の胚を準備するには、まず2種類の固定用溶液を作成します。一つは溶かしたワセリンで、もう一つはバッファーに2〜3%の agarose を加えたものです。

イメージングする構造体が非常に脆弱な場合は、沸騰させないように注意しながら、より高密度のarosを作成できます。2種類のストック溶液を電子レンジで溶解し、4〜5 mLずつ分注して保存します。イメージング当日は、Vaseline溶液のアリコートを65〜70 °Cのヒートブロックで溶解し、arose溶液のアリコートを電子レンジで溶解させます。

ここでも、沸騰させないように注意してください。次に、これらの溶液を溶融状態に保つため、ヒートブロックに保管します。続いて、2枚のスライドガラスの上下端をラボテープで留め、その2枚のテープ付きスライドの間に、清潔なスライドガラスを配置します。

次に、溶融したアガロースを数滴、清潔なスライドグラス上に滴下し、別の清潔なスライドグラスで覆います。アガロースが広がり、薄い正方形のパッド状になります。これでワームパッドの準備が完了しました。解剖顕微鏡と白金線ピックを使用して、成虫2匹を18×18 mmのカバーグラス上の9〜12 µLのバッファー滴に移動させます。

その後、切り離します。針またはメスを用いて、アガー側を下にした状態で虫体を切り開き、胚を放出させます。虫体のパッドを18 by 18 millimeterのカバーガラス上に配置し、はみ出したアガーをカミソリで取り除きます。

最後に、カバーガラスを密封するため、画筆または爪楊枝を用いて、その周囲に溶融したワセリン溶液を塗布します。これで、細胞をイメージングできる状態になりました。スライドを顕微鏡にセットする際は、2つの偏光フィルターが互いに垂直に揃っていることを確認してください。

ウォラーとプリズムの両方が光路から外れていることを確認してください。視野が暗くない場合は、コンデンサー下の偏光フィルターを回転させて、暗くなるまで調整します。10倍対物レンズを使用して胚を探します。

1つの視野内に複数の胚を取り込むため、虫体の近くにある若齢胚のグループを探してください。最適な画像を撮影するため、虫体内部にある胚は避けてください。最適な胚の位置が決まったら、より高倍率の対物レンズに切り替えます。

次に、フィルターキューブをDICに切り替えます。続いて、対物レンズ上のウォルストンプリズムを光路に挿入し、コンデンサーのターレットを回転させて、対物レンズに適合する下部ウォルストンプリズムを選択します。プリズムを配置した後、このターレットの下にあるスライダーを調整し、レンズの開口数（NA）に合わせます。

最適なケーラー照明を得るには、コンデンサー絞りの縁が最も鮮明に見えるまでコンデンサーの焦点を合わせます。「最も鮮明」とは、明部と暗部の境界が最もくっきりとしており、ピントが合っている状態を指します。最適なコントラストを得るには、スライダーのノブを回してアパーチャーストップとプリズムを調整してください。

これで顕微鏡はほぼ使用可能な状態になりました。次に、microManagerおよびオープンソースソフトウェアを用いて、コンピューター上で追加のイメージングパラメータを制御します。まず、カメラのゲインを0に設定してください。

次に、ファイルの保存形式を16ビットではなく8ビットのTIFFに切り替えます。TIFFファイルは、後にImage Jなどのオープンソースソフトウェアで解析することが可能です。続いて、最も明るいピクセルが飽和レベルの直下になるように、光量を調整します。正しく設定できていれば、光が斜めから差し込んでいるように見え、画像が3Dのように表示されます。

画像が鮮明に表示されたら、撮影したい胚を選択し、関心領域（ROI）を描画します。顕微鏡にフォーカスモーターが搭載されている場合は、それを使用して各タイムポイントで複数の焦点面を収集します。「Point open」で多次元取得ウィンドウを開き、フォーカスノブを調整して、卵黄顆粒がピントに合っている最初の焦点面と最後の焦点面を特定し、Zスタックの上面と下面を設定します。

ステップサイズを設定します。これにより、収集する焦点面の数が決定されます。次に、すべての焦点面を取得するのに十分な長さの時間間隔を設定してください。

最大タイムポイントを非常に高く設定することで、手動で停止するまでソフトウェアに画像を撮影させることができます。プロセスのモニタリングができるよう、最後に取得した画像のみを表示するようにソフトウェアを設定してください。次に、画像にファイル名を指定し、画像の取得を開始します。

画像解析については、次セクションの最後で簡潔に説明します。GFP動画の作成は、4D DICやMusky DICの作成とほぼ同様ですが、蛍光シャッターのソフトウェア制御を含む構成ファイルを使用します。胚を配置した後、上部ウォールストーンプリズムが光路に入っていないことを確認し、フィルターキューブをF-I-T-C-G-F-Pに切り替えてください。

ソフトウェアの起動時に自動的に設定されなかった場合は、カメラゲインが255に設定されていることを確認してください。画像ファイルは16 bit tiff形式に設定します。次に、透過光光源をオフにし、「live imaging」をクリックします。

蛍光信号の良好なSN比を得るために、UV光源の強度と露光時間を調整してください。ただし、細胞を保護するため、光露光は最小限に留めてください。次に、時間間隔を設定します。タイムポイント数と焦点面の数を設定し、前述の手順に従って画像取得を開始します。

動画を解析するには、オープンソースソフトウェアを使用します。MicroManagerプラグインをインストールしたImage Jを使用してください。非常に容量の大きい動画は、Lociプラグインを用いてImage Jにインポートすることも可能です。これは、nor maskyを用い、DIC光学系で撮影した野生型胚です。

右下が後方、左下が腹側です。動画では、15秒ごとに収集された単一焦点面の画像シーケンスを示しています。再生速度は14 fpsに設定されています。

この胚は最初の胚分裂時に蛍光を発しており、ここでは右上方向が後端です。この動画では、単一の焦点面における変化を10秒ごとに示しています。このビデオを視聴することで、DIC Naski光学系とエピ蛍光の両方を用いて生体胚をイメージングし、ダイナミックな現象を研究する方法について十分に理解できるはずです。

DIC Nomar光学系を適切にセットアップして最適な画像を得る方法について、より深く理解していただけたことと思います。また、エピ蛍光照明を用いることで高品質な蛍光データが得られるため、必ずしもより高度な顕微鏡に依存する必要はないという点をご認識いただけたかと思います。これらのイメージング技術を、特定の遺伝子機能が欠損した胚の観察に適用することで、細胞分裂や発生における関心のある現象における遺伝学的要求について、さらに詳細に調査することが可能です。