のための簡単なシート光顕微鏡を設定するトトでイメージングの C.虫開発
2014年5月5日
このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。
この手順の全体的な目標は、蛍光ライトシート顕微鏡を使用してCアラガンの開発を画像化することです。これは、まず、直立顕微鏡と小さな光機械要素のセットで構成されるライトシートベースの顕微鏡をセットアップしてライトシートを生成することによって達成されます。手順の2番目のステップは、胚をマウントすることです。
最後のステップは、ライトシートを胚に調整し、その発生を記録することです。その結果、CL eganの開発中に蛍光標識されたタンパク質のダイナミクスを、3Dおよびタイムラプスビデオの分析を通じて示すことができます。ライトシップ顕微鏡法が共焦点顕微鏡などの他の既存の方法よりも優れている点は、光毒性を抑えながらより高速なイメージングを可能にすることです。
第三に、この方法は、開発に対するシールについての洞察を提供することができます。また、リワールやゼブラフィッシュなどの他のシステムにも適用できます。手順のデモンストレーションが明確になります。
シェールズは私の研究室のエンジニアで、ポーリーン・リニアックはバンの研究室のエンジニアです。このセクションでは、セットアップアセンブリについて説明し、すべての実験で組み立てたままにしておくことができます。レーザー、フィルター、望遠鏡、潜望鏡をすべて光学テーブルに配置したら、シリンドリカルレンズを固定してライトシートを生成します。
ピントを合わせるためには、別のレンズを調整します。照明対物レンズの焦点は、検出対物レンズの物体の焦点と一致する必要があります。次に、ビームを壁またはスクリーンに投影し、投影の輪郭がシャープになるまで、照明対物レンズをビーム軸に沿って動かします。
クワッドライン蛍光フィルターとE-M-C-C-Dカメラを顕微鏡のセットアップに含めます。2 番目の手動移動ステージを最初のステージに垂直に固定します。アセンブリを既存の顕微鏡ステージにねじ込みます。
セットされたシリンドリカルレンズ照明対物レンズを取り外した後、アセンブリを顕微鏡に置き、照明セットをステージに戻します。照明光路と検出路の垂直交点にqveホルダーを取り付けます。次に、ライトシートを確認します。
ガラス製の獣医にフルオレセイン溶液を入れ、ステージ上のホルダーに入れます。ライトシートが見えているはずです。検出対物レンズに対して水平で中央に配置する必要があります。
次に、シリンドリカルレンズを取り外します。照明対物レンズの3D平行移動でライトシートを最適化し、画像を取得してライトシートの厚さを測定します。これは、対物レンズの絞りに依存します。
その後、必ずシリンドリカルレンズを交換してください。まず、厚さ1mmのガラスを10mm×20mmに切ります。ひし形のマーキングペンを使用します。
次に、20マイクロリットルのポリLリジンを片面に加え、乾いたら2枚目のスライドに並置します。固定位置に5%寒天を一滴加え、3枚目のスライドセットの重さで滑らかにします。寒天が乾いたら、3枚目のスライドを取り外し、ポリLリジンを含まないスライド上で残りの2つのスライドの端から3ミリメートルの寒天パッドをカットします。
次に、固定スライドを取り外し、寒天の張り出しを残します。寒天に20マイクロリットルのポリLリジンをコーティングし、乾燥させます。次に、Mナイン培地で満たされた時計のグラスにGRワームを解剖顕微鏡で入れます。
メスで外陰部までワームをカットし、卵を解放します。次に、目的の段階にある胚を特定し、マイクロキャピラリーピペットで収集します。胚を、寒天の境界ではなく、スライドの端のすぐ隣にある準備したスライドから張り出した寒天に移します。
次に、液体を除去しながら、胚をマイクロキャピラリーピペットで位置合わせします。吸引により、胚はポリオールリジンに付着します。良好な記録を得るためには、胚をしっかりと配置することが非常に重要であり、これには適切なアプチュアを持つ毛細血管が必要です。
小さすぎると、胚を放出するのが難しくなります。大きすぎると、漏れた流れをしっかりと制御し、胚を整列させることが難しくなりますので、スライドをペトリ皿にM nine培地で覆い、胚がまだ寒天に付着していることを確認します。次に、準備したスライドに胚を入れて、獣医に収まるサンプルホルダーに固定します。
ホルダーは、獣医にフィットするように設計された自社製のからくりです。次に、獣医をPizo電気ステージに固定し、明視野照明の下で胚を見つけます。次に、音響光学チューニング可能なソフトウェアパッケージを起動します。
カメラとステージをフィルタリングします。このソフトは社内で書いたものですが、micromanagerのフリーウェアでも使えます。まず、レーザーラインを選択します。
次に、ライトシートが最も明るくなるまで、x軸に沿ってステージを調整します。次に、信号対雑音比が最高になるまで、他の2つの次元(YとZ)を調整します。これは、各胚に対して繰り返す必要があるかもしれません。
この鍵は、信号と比率を最適化して、フリーステージの翻訳を行い、胚のousシミュレーションと最高のコントラストを得るだけの関係で、排除の目的とのサポートを得るための良好な記録を得るためのものです。次に、タイムラプス画像を取得し、胚の蛍光レベルと分析された生物学的プロセスの速度に応じて、レーザー出力の露出、時間ゲイン、およびイメージング間隔を設定します。ザックのために。
イメージングは、ヒストンGFPコンストラクトを発現するc elganでスライスとその開始位置および終了位置との間の距離を設定します。2時間のタイムラプスイメージングは、37秒ごとに20スライススタックを撮影して行われました。細胞分裂は、GFPに融合したチューブリンを発現する株ではっきりと見え、彼の結石をmチェリーに融合させた記録は、105秒ごとに16分間行われました。
3D レンダリングは 3 つの時点で表示されます。有糸分裂紡錘体と凝縮した染色体ははっきりと見え、細胞分裂を通じて簡単に追跡できます。GFPに融合した第3の株であるAPOリポタンパク質vit 2を、細胞膜のmCherry標識で画像化した。
13 分間で、27 秒ごとに 10 個のスライススタックが取得されました。動きの速いリポタンパク質粒子は追跡が容易でした。ここでは、より複雑な方法で形成されたライトシートを使用して製造します。
ライトシートは、空間分解能をさらに向上させるために実装される場合があります。
概要
このプロトコルでは、ライトシート顕微鏡のセットアップと、C. elegans 胚の生体内（in vivo）イメージングへの実装について説明します。この手法により、共焦点顕微鏡と比較して、光毒性を抑えつつより高速なイメージングが可能になります。
主要研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 顕微鏡法
背景
- ライトシート顕微鏡法は、生物学的サンプルのイメージングに対する独自のアプローチを提供します。
- この手法は、特に生体胚の観察に有用です。
- 光損傷を最小限に抑えつつ、高速なイメージングを可能にします。
- 応用範囲は、C. elegans 以外のさまざまなモデル生物にまで及びます。
研究目的
- 蛍光ライトシート顕微鏡を用いて、C. elegans 胚の発育を可視化する。
- 発育過程における蛍光標識タンパク質のダイナミクスを解析する。
- 従来の手法に対するライトシート顕微鏡の優位性を実証する。
使用した手法
- 光学系素子を用いたライトシート顕微鏡の構築。
- アガーパッドを準備したスライドへの胚の固定。
- イメージングのためのライトシート光軸調整の最適化。
- 発生過程を捉えるための胚のタイムラプスイメージング。
主な結果
- C. elegans 胚における細胞分裂およびタンパク質ダイナミクスのイメージングに成功。
- 有糸分裂紡錘体および染色体の3Dレンダリングを取得。
- 高速で移動するタンパク質のトラッキング能力を実証。
- 当該生物の発育過程に関する知見を提供。
結論
- ライトシート顕微鏡法は、生体内イメージングのための強力なツールです。
- この手法により、胚発生の理解が深まります。
- この手法は、他のモデル生物への適用も可能です。
よくある質問
産業界における重要性
ライトシート顕微鏡法は、個体全体の発生過程において、高解像度かつ低光毒性のイメージングを可能にし、定量的でダイナミックな表現型データを提供することで、初期創薬におけるターゲットバリデーションを支援します。このアプローチでは、生体システム内での細胞プロセスやタンパク質動態の縦断的な追跡が可能となるため、前臨床モデルにおける生物学的な不確実性を低減できます。また、ハイコンテントスクリーニングのワークフローに適合する、再現性と拡張性のあるイメージング出力を提供することで、リード化合物同定における予測信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値： 発生中の胚におけるタンパク質ダイナミクスと細胞分裂をサブセルラー解像度で可視化することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 低光毒性条件下で発生表現型の再現性のある定量的な読み取り値を提供し、生物学的リスクの低減をサポートする。
- 予測的価値： 分子レベルの摂動と発生結果を相関させる縦断的なマルチパラメータデータセットを生成し、ポートフォリオの選別を容易にする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： サブセルラー解像度での標準化された3Dタイムラプスイメージングを実現し、個体レベルでの信頼性の高い化合物効果の評価を可能にします。
- 運用的価値： 精密なライトシートの調整と安定化によりアッセイの再現性を確保し、長期的なイメージングセッションにおけるばらつきを最小限に抑えます。
- 拡張性： マルチウェル観察チャンバーおよび自動ステージ制御に対応しており、中スループットのスクリーニングキャンペーンをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：標準化されたイメージングプロトコルを用いて、複数のモデルシステム間で一貫した表現型評価を可能にすることで、発見段階から前臨床検証への橋渡しを行います。
- メカニズム的なリスク低減：標的結合が発達プロセスに及ぼす影響を直接観察できるため、作用機序研究における曖昧さを低減します。
- リスク調整後の進展：発達毒性と表現型の正常化指標に基づいた、go/no-go決定のための定量的な閾値を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションからリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに組み込むことができ、個体レベルのモデルにおける表現型スクリーニングやメカニズム研究のための、非破壊的で定量的なイメージング手法を提供します。
- 探索生物学： 胚発生中の蛍光標識タンパク質および細胞構造のリアルタイム追跡を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 標準化されたスライド調製、ライトシート特性評価、および胚のマウントプロトコルにより、イメージングの整合性を確保し、アッセイの準備を整えます。
- 分析： 定量的な3Dおよびタイムラプスリードアウト（例：有糸分裂紡錘体のダイナミクス、タンパク質輸送）を生成し、異なる実験条件間での客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 保存された発生経路の検証済みモデルであるC. elegansを用いて、疾患に関連する表現型リードアウトを提供し、前臨床研究への連続性を構築します。
- エンタープライズでの再利用： 光学定盤上に左側から組み立てるモジュール式システムとして設計されており、最小限の再校正でプロジェクトをまたいだ繰り返し利用が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：タンパク質のダイナミクスと細胞挙動を直接的かつ経時的に観察することで、メカニズム的な曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：標準化された光学・機械的なアライメント、スライド標本作成、および胚の固定手順により、再現性とスケールアップを強化します。
- 戦略的価値：発生毒性の早期検出を可能にすることで、未特定のリスクによる後期の脱落を減少させ、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：定量的な画像ベースの表現型スコアを提供することで、ターゲットクラス全体における推進判断に役立て、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- 光学アライメント、蛍光顕微鏡法、およびライブイメージングのための試料調製に関する専門知識が必要です。
- 安定した光学定盤、レーザー光源、対物レンズ、移動ステージ、および検出用のEM-CCDまたはsCMOSカメラが必要です。
- ユーザー間および施設間での再現性を確保するため、スライド調製、胚のステージ判定、およびイメージングパラメータのチーム間での標準化が求められます。
- 他のモデルシステム（ゼブラフィッシュ、Drosophilaなど）へ拡張する場合、胚のサイズ、光学透明化、および封入剤の適合性を検討する必要があります。
- 実用上の制限として、胚の固定効率および広視野におけるライトシートの均一性が挙げられ、長時間のイメージングセッションでは最適化が必要になる場合があります。
