拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

本手順の全体的な目的は、拍動型バイオリアクターシステムを用いて、生物学的根拠に基づいた血管グラフトを作製することです。これは、細胞が成長するための足場となるPGAメッシュから生分解性スキャフォールドを調製し、それらをバイオリアクターチャンバー内に組み込むことで達成されます。その後、スキャフォールドに平滑筋細胞を播種し、空気および給餌チューブのシールが付いた蓋でバイオリアクターチャンバーを密閉します。

次に、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクター内の血管に拍動流を供給します。リアクター内で細胞が血管へと成長し、免疫化学的、生化学的、および機械的な試験に合格します。この技術は、動脈バイパス用の移植可能な小径血管グラフトを再生するための有望なアプローチであるため、冠動脈疾患の治療への応用が期待されます。

この手法は血管工学への知見を提供できるだけでなく、周期的な生理学的負荷を受ける他の器官系にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。スキルを完全に習得するには、多くの練習が必要です。

私たちは、工学的構築物を再生させるために生理学的な機械的刺激を適用することの重要性に気づいたとき、初めてこのアプローチを考案しました。バイオリアクターの操作プロセスは工程が多く、詳細な実演を通じてのみ習得できるため、この手法を視覚的に示すことが極めて重要です。まず、蒸留水を用いて内径 3 mm のシリコンチューブを 30 cm の長さに切り出したセクションを洗浄し、自然乾燥させます。

ハサミを使用して、チューブ1本につき1.1 cm × 8 cmのPGAメッシュを切り出します。止血鉗子を用いて、Dexon 6.0縫合糸でPGAメッシュをチューブに固定し、外科結紮を3回行い、続いて止血鉗子でシングルステッチを行います。これにより固定されたメッシュがPGAスキャフォールドとなります。まず、スキャフォールドを1 Mの水酸化ナトリウム溶液に1〜2分間浸し、次に蒸留水に2分間ずつ3回浸して洗浄します。洗浄の合間には軽く水分を拭き取り、3回目の洗浄後はフード内で15分間自然乾燥させます。

乾燥後、メッシュの両端に1 cmのダクロンカフを3針で縫い付けます。チューブを2〜3 mm重ねて配置し、チューブに穴を開けないようにしてください。このプロトコルの後で使用するため、約15 cmの縫合糸をそのまま残しておいてください。

すべてのバイオリアクターの構成部品およびツールは、事前にオートクレーブ滅菌します。バイオリアクターでの培養を開始する前日に、バイオリアクターの一部を組み立て、バイオリアクターの構成部品、スキャフォールド、メッシュ、シリコンチューブ、手術器具、およびバイオリアクターの全長より長い細いワイヤーを、70%エタノール液に少なくとも30分間浸漬させます。ワイヤーを使用して、シリコンチューブをリアクターのサイドアームに通します。

次にバイオリアクターを取り出し、フレア状のガラス縁の上にダクロンカフを固定して、内部にPGAスキャフォールドを取り付けます。余った縫合糸を使用して、各カフを縛り付けて固定します。次に、コネクターを用いて、スキャフォールドの一方の側のシリコンチューブをバイオリアクターアームの1ペアに接続し、スキャフォールドのもう一方の側のチューブを残り2本のアームに接続します。

コネクターを取り付けたら、サイドアームからそれらを引き抜き、バイオリアクター内をエタノールで洗浄します。リアクターを両側それぞれ10分間浸漬させます。バイオリアクターをペトリ皿の上に置き、組織培養液で洗浄します。

水を流して洗浄します。ピペットを使用して、メッシュとチューブ内も確実に洗い流してください。次に、後で使用するために滅菌済みの撹拌子をリアクターに入れ、ここからブロワーをオンにし、UVランプをオフにした状態で、フード内で装置を一晩乾燥させます。

コンタミネーションの原因となるため、リアクターの上に身を乗り出さないでください。セットアップ時には、すべてのコネクタをアルコールで拭いて洗浄する必要があります。接続を行う前に、多くの接合部をパラフィルムで補強します。パラフィルムは使用前に70% ethanolに浸しておく必要があるため、アルコールとパラフィルムを十分に用意してください。

予防策として、バイオリアクター内部のPGAスキャフォールドを汚染から保護するため、各バイオリアクターの開口部に滅菌済みのペトリ皿を置いて準備します。次に、バイオリアクターの3番目の未使用アームに注入ポートを取り付け、セットアップを開始します。続いて、IVバッグをフローシステムに接続します。

walrusチューブセットを用い、青色の端をY字接合部の可能な限り近くで結び、チューブをクランプします。赤色のチューブをIVバッグの反対端に取り付けます。次に、白色のチューブをフローシステムの片側に取り付けます。

3方コックをフローシステムに挿入します。プレッシャートランスデューサーチューブの一端をストップコックに接続し、もう一端を点滴バッグの中央の開口部に接続します。次に、フローシステムを部分的に満たして漏れを確認するため、350 millilitersのPBSと1% fungi zoneを点滴バッグに加えます。

フローシステムに接続する前または後に、60 mLのシリンジを使用して、ストップコックを調節してPBSの流れ方向を制御し、バッグを絞ってシステムをフラッシュします。この手順は、細胞の播種前または播種後のどちらでも行えます。これで、バイオリアクター内に細胞を播種することができます。

この例では、1枚のコンフルエントなT 75フラスコ分に相当する約800万個のSM細胞を1.25 mLの培地で再懸濁し、ダクロン接合部からダクロン接合部まで、PGAスキャフォールド上に均一に滴下します。細胞を添加した後、バイオリアクターのリムをアルコールで拭いて清浄にします。リアクターの上に身を乗り出さないようにしてください。

次に、シリコンストッパーのリッドを慎重に組み立てます。オートクレーブバッグから取り出す際や、それに続く取り付け手順の間、リッドの底部を露出させないように注意してください。まず、注入ポートをフィードチューブのオスコネクタに取り付けます。

次に、3つのエアポートそれぞれにPTFE 0.20 micronフィルターを取り付けます。続いて、注入ポートをフィルムで密閉します。組み立てたシリコンストッパー蓋をガラスバイオリアクターに挿入します。

給餌チューブが設置済みのPGAスキャフォールドに触れないようにしてください。その後、パラフィルムで密封します。次に、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクターとフローシステムを37 degrees Celsiusのインキュベーターに入れます。

リアクターを横向きに置き、5分ごとに回転させる操作を25〜30分間行います。次に、インキュベーター内にある状態で、ポンプを用いてフィーディングチューブから4:10培養液400 millilitersをバイオリアクターチャンバーに充填します。その後、拍動ポンプを停止させた状態で、播種したスキャフォールドを37 °C、5% carbon dioxideの条件下で6〜7日間インキュベートします。

ポンプを起動するまで、培地交換やビタミンCの補充を行う必要はありません。ポンプをオンにする前に、チューブに漏れや屈曲がないか確認してください。次に、ポンプの速度を調整し、圧力を-30から270 mmHgの範囲に維持します。培養期間中は、毎日この圧力を監視し、維持してください。

培地の交換およびアスコルビン酸の添加は、脈動ポンプを用いて新鮮な培地を供給しながらスキャフォールドを成長させている間に、週2回行う必要があります。まず、培地の交換と廃液回収の両方の目的で、供給用リッドに注入ポートとPTFEフィルターを取り付けます。次に、供給チューブを双方向ポンプにしっかりと固定し、一方の端をバイオリアクターの供給ポートに、もう一方の端を供給用リッドに挿入します。その後、200 millilitersの培地をゆっくりとポンプで排出します。

ポンプの速度を徐々に上げます。次に、新しい供給チューブを取り付け、200 millilitersの新鮮な培地をゆっくりとポンプで注入し始めます。リアクターにアスコルビン酸を添加するには、滅菌済みの30 milliliterシリンジを用いて、培地を25 milliliters分取り除きます。

滅菌アスコルビン酸溶液を5 mL添加し、その後、25 mLの培地に戻します。作製された血管は、8週間の培養後に不透明に見え、壁厚は約250 µmになります。拍動条件下での作製血管のヘマトキシリン・エオシン染色により、組織形態が時間経過および拍動に伴って変化することが示されます。

血管の内腔側はLで示されており、マッソン・トリクローム染色（masson's tri CHRO stain）が施されています。コラーゲンについては、4週間のパルス負荷を与えた血管は、非パルス負荷の対照群よりもコラーゲンが多いことが示されています。白い矢印は、12週時点での血管内に残存しているPGA断片を指しています。免疫化学的分析により、早期平滑筋マーカーであるalpha actin、中間平滑筋マーカーであるcal poin one、および後期平滑筋マーカーであるmyosin heavy chainの発現が示されています。この手法を習得すれば、適切に実施することで7〜8時間で完了させることができます。

本手順を実施する際は、本プロトコルに従い、あらゆる操作を可能な限り清潔かつ無菌的に行うことが重要です。また、in vivo研究における構築血管の維持における管腔表面修飾の重要性など、さらなる疑問を解消するために、構築血管の管腔の修飾といった他の手法を、開発後に行うことができます。

この手法は、組織工学、特に血管工学の分野の研究者が、動物モデルにおける冠動脈疾患の潜在的な治療手段を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、動的後培養を通じて移植可能な人工血管グラフトを実現する方法について、十分な理解を得ることができるはずです。水酸化ナトリウムを取り扱う際は危険が伴うため、本手順の実施中は常に保護メガネや白衣などの予防策を講じてください。