動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

このビデオでは、動脈組織工学のために多孔性管状スキャホールドを作製し、動的な機械的刺激を加える方法について説明します。まず、生分解性エラストマーと溶融融合法を用いてスキャホールドを作製します。その後、細胞播種のための準備を行い、バイオリアクターシステムに組み込みます。

バイオリアクター内で、血管平滑筋細胞をスキャホールドに播種し、培養します。数週間後、組織を回収し、走査電子顕微鏡観察、H&E染色、およびエラスチンの自己蛍光を用いて解析します。得られた平滑筋は、多層構造であり、かつ垂直方向に配向しています。

粒子ブリーチングのようなこの手法の主な利点は、ガラス型を用いてヒアルロン酸から多孔質管状足場を作製できることです。型を除去すると、足場が完成します。まず、ガラス管を用いて足場型を準備します。管をホルダーに固定し、前日に調製したヒアルロン酸溶液を管の中に注入します。

ヒアルロン酸が内壁に沿ってゆっくりと流れ落ちます。溶液がモールドの底に到達したら、モールドを反転させます。モールドの内壁が溶液で均一にコーティングされるまで、この手順を繰り返します。

コーティング後、準備したすべてのガラス型を真空オーブンにて37 °Cで24時間乾燥させます。通常、ガラス型の乾燥中に4つの型を同時に準備します。塩粒子の注ぎ込み準備として、SVE塩粒子を25〜32 µmまで粉砕します。

翌日、準備したガラス製モールドマンドレル、PTFEチューブ、熱収縮スリーブ、およびPTFEリングを組み立てます。まず、65 mmの長さに切ったPTFEチューブにマンドレルを挿入し、120 °Cで5分間加熱します。PTFEを収縮させるため、待機している間にハイブリダイゼーションインキュベーターを37 °Cで少なくとも30分間予熱しておきます。

チューブでマンドレルを覆ったら、熱収縮スリーブをマンドレルに押し込み、自由に動くようにします。次に、マンドレルをガラス型の中に入れ、マンドレルの底にA-P-T-F-Eリングを取り付けます。PTFEリングがガラス型の底にぴったりとフィットしていることを確認してください。

次に、スパチュラとシリコンゴム製漏斗を使用して、塩粒子粥をガラス型に加えます。その後、粒子が均一に分散するようにスパチュラで型を軽く叩き、余分な塩を削り取ります。ここで加温インキュベーターの電源を切り、速やかに塩を充填した型を入れます。その後30分かけて塩が融着し、その後、真空オーブンにて37 °Cで24時間、型を乾燥させます。

冷却後、翌日にPTFEリングを固定しながら押し出すことで、金型からステンレス製マンドレルを取り出します。必要に応じて、ラジオペンチを使用してください。その後、金型の底部からPTFEリングを取り除きます。

次に、型を加熱してスリーブを収縮させ、収縮したスリーブを型から取り出します。型は次に使用するまで冷却し、フード内のデシケーターで保管してください。スポイトを用いてガラス型を45度に傾け、型をゆっくりと回転させながら内腔にPGS溶液を滴下します。

PGS溶液がモールドの壁面に沿って流れ落ちているかを確認します。乾燥した箇所がある場合は、PGSを追加してください。その後、ドラフト内で少なくとも30分間、THFを揮発させます。THFが完全に揮発したら、真空オーブンでモールドをキュアします。

1日間硬化させた後、型を室温まで冷却し、24 °Cの脱イオン水にゆっくりと垂直に浸します。急激に傾けると気泡が発生し、スキャフォールドが破れる原因となります。型を慎重にウォーターバスに移してください。

シリコンチューブを使用して斜めに配置し、ヒアルロン酸を1時間かけて溶解させます。1時間後になってもヒアルロン酸が型から離れない場合は、型を浸したまま、スパチュラを用いてヒアルロン酸を両端からゆっくりと押し出し、その後、型をゆっくりと振ってください。次に、ガラス型の中でスキャフォールドが移動していないかを確認し、移動している場合は、ピンセットでスキャフォールドをゆっくりと引き出して型から取り出します。

次に、繊細なスキャフォールドを脱イオン水バスに慎重に移し、緩やかに攪拌して塩粒子を浸出させます。この工程には少なくとも3日かかり、水は毎日交換する必要があります。塩がすべて浸出された後、各スキャフォールドを脱イオン水で満たした15 milliliter遠心チューブに移し、ドライアイスボックスで1時間凍結させます。凍結した遠心チューブのキャップを開けた状態で、凍結乾燥機に3日間設置します。

凍結乾燥後、スキャフォールドを使用するまでデシケーター内で保存します。まず、スキャフォールドを25〜30 mmの長さに切断します。次に、各ストッパーの中央の穴にPTFEチューブを通し、2つのシリコンゴムストッパーを準備します。

次に、熱収縮チューブを1.5 mmの長さに切り、スキャフォールドの一端にスライドさせます。ストッパーに接続されたPTFEチューブを、熱収縮チューブの下に入り込む程度のわずかな重なりを持たせてスキャフォールドの同じ端に押し込み、スキャフォールドとチューブを強固に接続します。その後、オーブン内で熱収縮チューブを収縮させ、アセンブリを室温まで冷却させます。ここで、バイオリアクターチャンバーとして機能する50 mmのポリカーボネートチューブをスキャフォールドに被せ、シリコンゴムストッパーの内表面で固定します。

前述と同様に、もう一つのPTFEチューブとストッパーをhsリングでスキャフォールドの反対端に固定し、チャンバーを完成させます。2つ目のストッパーはポリカーボネートチューブの反対端に取り付けます。次に、ストッパーの外表面を2枚のアルミニウム合金プレートに固定します。

2本のネジ山付きロッドを各プレートのサイドホールに差し込み、サムスクリューでプレートを固定します。その後、スキャフォールドをバイオリアクターに取り付けます。次に、2つのhsリング間の距離である各スキャフォールドの可視長を測定し、それらの内表面積を算出します。

細胞播種用です。オートクレーブを用い、アルミ箔で個別に包装したチャンバーとバイオリアクターユニットの各部品を滅菌します。滅菌後、細胞培養フード内でバイオリアクターを組み立てます。

ペリスタポンプを使用し、フロー回路内で1 mm/minの速度で一連の灌流を行い、スキャフォールドの前処理および洗浄を行います。まず、70% ethanol、50% ethanol、次いで25% ethanolを用いて、それぞれ1時間ずつ洗浄します。これら3回のエタノール洗浄の後、PBSで2時間洗浄します。

最後に、バイオリアクターにSMC培地を24時間灌流させると、細胞播種および実験の準備が整います。次に、付属の論文の指示に従い、1cm²あたり200万個の細胞をバイオリアクターに播種し、その後21日間にわたってチューブ内の培地を交換し、ポンプ速度を調整します。構築物内の圧力は、培養1日目の約4 mmHgから、培養2週間後には100 mmHg以上に徐々に上昇します。培養3週間後、細胞を回収し、付属の論文に規定された方法で解析の準備を行います。

これらの管状PGSスキャフォールドは、ソルトフュージョン法によって作製されました。走査電子顕微鏡写真により、すべてのスキャフォールドが均一な壁厚を有しており、断面に部分的な欠陥がないことが示されました。また、すべてのスキャフォールドの内腔表面に、ランダムに分布したマクロ孔およびマイクロ孔が観察されました。

細胞培養後、多層化したSMCは流れの方向に対して垂直な配向で増殖しました。さらに、細胞とDCMタンパク質がすべてのPGS構築物の管腔を完全に被覆していました。また、エラスチンの自己蛍光により、構築物の管腔表面において円周方向に組織化された弾性繊維が確認されました。

このビデオを視聴することで、多孔質管状スキャフォールドの作製方法、細胞の観察、および設計済みのバイオリアクターを用いたスキャフォールドの培養方法について理解することができます。