肺のエンジニアリングのための手順

本手順の全体的な目的は、形態的および生理学的に生体肺組織と同等な培養肺組織を作製することです。まず、成体ラットから心臓と肺を摘出します。次に、肺動脈と気管にカニューレを挿入し、カニューレを装着した肺を脱細胞化用のバイオリアクターに接続します。

脱細胞化と洗浄後、肺を滅菌培養バイオリアクターに移し、播種（シーディング）の準備を行います。本手順の最終ステップは、準備した細胞集団を肺の目的のコンパートメントに播種することです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、脱細胞化された細胞外マトリックスに、領域特異的な肺マーカーを発現する細胞が効率的に再集積した結果を得ることができます。

この手法が、既存の肺細胞のin vitro培養法に対して持つ主な利点は、細胞が分化した表現型を長期間維持するため、3次元的な生物由来基質中で数週間にわたって研究できる点にあります。脱細胞化では、肺を血管カニューレを介してバイオリアクターキャップに接続し、そのキャップを脱細胞化装置に接続します。肺の上にあるガラス瓶は、リングスタンドとアタッチメントクランプで固定します。

この段階で、細胞成分を除去して細胞外マトリックススキャフォールドを作製し、そこに再び細胞を導入することができます。工学的に作製した肺組織の播種および培養のためのバイオリアクターの構成をこの図に示します。気管カニューレのルアーロックコネクタは、気管リザーバーとメインチャンバーの間の呼吸ループに接続されます。

呼吸ループには2つのワンウェイバルブが含まれています。これにより、培地が肺への流入時と流出時で異なる経路を辿るように配置されています。また、内皮細胞を播種するため、灌流ラインに小さなリザーバーが一時的に組み込まれています。

拍動ポンプを用いて、リザーバーから肺の血管区画へ細胞を輸送します。血管灌流にはローラーポンプを使用します。培地は装着されたカニューレを介して肺動脈に灌流され、肺血管内を流れて肺静脈からメインバイオリアクターへと直接排出され、そこで灌流用に培地が吸引されます。

肺上皮を呼吸ループ内に注入して配置します。肺を収容するメインチャンバーと気管リザーバーを、長期的な肺培養に使用します。肺を摘出し、動脈と気管を適切にカニューレ化した後、摘出したばかりの肺に空気を入れて漏れがないことを確認してください。

これは、液体に浸した状態で空気を注入することで確認できます。空気漏れを示す気泡が発生しないことを確認してください。プロトコルを開始するには、肺が満たされるまで（ただし過剰に膨らませないこと）、sodium nitropress sideを含むPBSを注入し、直ちに気管カニューレをキャップして肺が膨らんだままの状態を維持します。

次に、PBSとSNPを用いて、15 mmHgの圧力で肺を15分以上灌流します。その後、気管カニューレからストッパーを取り外し、肺を虚脱させます。必要に応じて、PBSとSNPによる灌流をさらに15～30分間継続してください。

PBSとSNPを補充し、灌流圧が10から15 mmHgに維持されるようにします。長期脱細胞化の手順を開始するために、バイオリアクターキャップを脱細胞化装置に接続します。次に、肺をキャップに接続します。

Y字型カニューレに連結されたルアーロックコネクタを使用して、肺動脈カニューレを灌流ラインに接続し、気管カニューレは固定せずに浮かせておきます。組織を完全に脱細胞化させるためには、システム内に空気が混入しないようにすることが極めて重要です。動脈および気管カニューレにある逆止弁は、チューブ内で逆流を可能にすることで、チューブ内の気泡を除去するのに役立ちます。

したがって、シリンジを用いて気泡を除去し、すべてのラインに空気が混入していないことを確認します。脱細胞化溶液による灌流を開始します。脱細胞化溶液で灌流します。

500 millilitersの溶液が肺を灌流するまで、最適な圧力は15 millimeters of mercury未満に維持します。これには通常2.5時間かかります。流速は通常、初期は非常に緩やかで、2時間目に約one milliliter per minuteまたはそれ以上の速度まで急速に上昇させます。

灌流中、肺と気管カニューレを維持するのに十分な液量を確保しながら、バイオリアクターから使用済みの脱細胞化液を定期的に除去します。脱細胞化液による灌流が完了したら、肺とバイオリアクターを組織培養用フード内へ移動させます。臓器の洗浄を開始するために、脱細胞化液が入った500 mLのジャーを取り除き、最大1 Lの滅菌PBSを入れた滅菌ジャーと交換します。

真空吸引またはシリンジを使用して、ライン内に空気が混入していないことを確認し、同様の方法で10～15 mmHgの圧力でPBSを血管系に灌流させます。脱細胞化の際と同様に、無菌操作を用いてバイオリアクターから廃PBSを定期的に除去し、PBSジャーを交換または補充してください。新鮮で滅菌済みのPBSを用いて、少なくとも2.5 Lの滅菌PBSが肺に灌流されるまで洗浄を続けます。

通常、洗浄が完了し脱細胞化プロセスが開始されてから2日かかります。肺を、新鮮なPBSに10%FBSおよび10%Pen strepを添加した新しい滅菌バイオリアクターシステムに移し、灌流ループ全体と気道ライン全体の両方に液体が満たされていることを確認します。ここからは、拍動ポンプを使用して5 mm/minで肺を灌流します。

10% FBSおよび10% ペニシリン・ストレプトマイシンを含むPBSを用いて、肺細胞外マトリックススキャフォールドを一夜かけて灌流し、滅菌します。この工程が完了した後、肺を37°Cのインキュベーターに1時間、または温度が平衡状態になるまで転移させます。Ben Nase処理の準備として、次のステップで肺にBen Nase処理を行います。

各肺の残留DNAを除去するために、まず1本の10 milliliterシリンジに加温したBen Nase bufferのみを充填し、もう1本の10 milliliterシリンジにBen Nase bufferで希釈した90 units per milliliterのBen Naseを充填します。肺の灌流を停止してください。

次に、肺に空気が注入されないように注意しながら、Ben Naseバッファーで気道を膨張させます。1分間、肺を脱気させます。その後、Ben Nase溶液で肺を膨張させます。

再度、Ben Naseで膨らませた後、肺に空気が入らないように注意します。灌流や換気を行わずに、37 °Cで1時間静置します。1時間後、バイオリアクター内にあるPBS + 10% FBS + 10% ペニシリン・ストレプトマイキシンを用いて灌流を再開し、翌日まで一晩灌流を継続します。

すすぎと滅菌後、長い細胞外マトリックススキャフォールドを細胞再播種に向けて準備します。P-B-S-F-B-S benzo a溶液を250 millilitersの培養液に置き換え、細胞を導入する前に少なくとも1時間灌流させ、細胞を播種する直前に新鮮な培養液に交換します。

臓器の再構築には、多くの細胞源を利用することが可能です。ここでは、上皮細胞集団を用いた播種について実演します。まず、目的の上皮細胞集団の細胞懸濁液 15 milliliters を含むシリンジを準備します。

次に、気道リザーバーに80 millilitersの培養液を満たし、すべての通気ラインから空気が抜けていることを確認します。その後、バイオリアクターを37 degrees Celsiusの組織培養インキュベーターに入れ、通気用のシリンジポンプを接続します。15 milliliterの細胞懸濁液を気管カニューレに注入し、単回の急速ボーラス投与により肺に細胞を播種します。

メインバイオリアクターのエアフィルターがキャップで閉じられていることを確認してください。次に、シリンジポンプを用いて、メインバイオリアクターから3 mL/minの速度で60 mLの空気を抽出する、ゆっくりとした1回の呼吸を直ちに開始します。この操作には約20分かかります。

その後、肺を約18時間静置します。次に、約0.5 milliliters per minuteの低速で血管灌流を開始します。臓器培養中の灌流は、通常1 to 3 milliliters per minuteで行われます。

上皮培養においてローラーポンプを使用する場合、通常、換気は1分間に1回の呼吸回数、および5～10 mLの1回換気量で継続的に行われます。シリンジポンプを使用する場合、メインチャンバー内の圧力を陰圧と大気圧の間で交互に変化させることで呼吸を再現するため、空気が周期的に吸引および注入されます。換気中はバイオリアクターの気密性を維持する必要があるため、毎日換気を一時停止し、メインチャンバー内の空気を交換する必要があります。

さらに、培地は約3〜4日ごとに交換する必要があります。培養中、肺上皮および血管内皮を培養することにより、毎回全容量の約半分を交換します。バイオリアクターに装着されたスキャフォールド内で、短時間ながらガス交換が可能な肺組織を構築することができます。

脱細胞化されたラット肺のH&E染色との比較のため、ここにラット肺原生組織の標準的なヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示します。最終的な脱細胞化細胞外マトリックスは、細胞成分が完全に除去されており、かつ原生肺の肉眼的、顕微鏡的、および超微形態的特性を保持している必要があります。H&E染色により、脱細胞化や洗浄が不十分であったためにスキャフォールドに残留しているDNAの可視化が可能となり、細胞播種およびその後の肺培養における最適条件を判断できます。

バイオリアクターにより、肺の5つの葉すべてに細胞が均一に分布し、細胞外マトリックススキャフォールドの約70%が被覆される必要があります。これらの画像は、免疫蛍光染色を施した天然の肺と再細胞化した肺を比較したものです。主要な肺マーカーについて、培養細胞群はClara細胞分泌タンパク質（pro secretory protein C）およびAquaporin 5に対して陽性を示しています。

すべてのパネルにおいて、標的マーカーは赤色で、DAPI染色された核は青色で示されています。脱細胞化から再細胞化までのこの手順に習熟すれば、適切に実施することで4〜5日で完了させることができます。