マウス肺切除術および義歯移植による内臓肺表面積の標準化法
2017年7月26日
内臓の肺表面積（ISA）は、肺疾患および傷害誘発性肺胞再生における肺の形態学および生理学を評価するための決定的な基準である。ここでは、肺の肺切除術とプロテーゼ移植マウスモデルの両方でISAの測定バイアスを最小限に抑える標準化された方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、肺摘出術およびプロテーゼ移植後のマウス肺の内部表面積を正確に測定することです。この方法は、機械的な力によって誘発される成人の肺再生における肺の形態学的および生理学的機能を分析するのに役立ちます。この技術の主な利点は、肺の内部表面積を正確に定量化することであり、これにより肺機能状態の信頼性と再現性が向上することが期待されます。
腹側にアクセスできる挿管プラットフォームでマウスを手術の準備します。次に、舌を引き出し、ガイディングカテーテルと互換性のある小動物用喉頭鏡で声帯を検査します。次に、20ゲージの静脈内挿管カニューレを気管の内側の角度で静かに挿入します。
次に、マウスを右横臥位に置き、カニューレを機械式人工呼吸器に接続します。胸部を観察して、カニューレが気管に挿入されているかどうかを判断します。吸気圧を水深12センチメートルに設定し、呼吸数を毎分120回に設定します。
次に、露出した皮膚を少なくとも3回交互にベタジンと70%エタノールで洗浄します。次に、5番目の肋間腔に2〜3センチメートルの後外側開胸切開術で手術を開始します。Noyesスプリングハサミを使用して筋肉組織を貫通します。
次に、1.5センチの切開を行い、左肺を露出させます。手術中、必要に応じて、高温焼灼器を使用して出血を止めます。次に、先端が鈍い鉗子で左肺葉の1/3を胸から持ち上げ、綿棒を使用して左肺全体を引き出します。
次に、左肺葉の肺動脈と気管支を特定し、浸した外科的縫合糸で気管支と血管を門でしっかりと結紮します。次に、結紮から3〜4mm離れた左肺葉を切り取り、縫合糸が切れて気胸にならないように注意します。次に、1本の縫合糸で胸壁を閉じます。
次に、3〜4ミリメートルの隙間がある5〜6本の中断された縫合糸を使用して、筋肉層と皮膚層を順番に縫い合わせます。外科用縫合針は必ず心臓から遠ざけてください。心臓穿刺は致命的です。
最後に、手術部位をポビドンヨードで消毒します。次に、マウスを摂氏38度のサーマルパッドに置きます。自発呼吸が戻るまで人工呼吸器を使用し続けます。
前述の手術を行いますが、肺を切除した直後に、プロテーゼを挿入する準備をします。鈍い鉗子を使用して、楕円体シリコーンプロテーゼの中心をつかみます。次に、鉗子で肋骨を押さえて胸腔を露出させながら、プロテーゼを非常に優しく挿入します。
プロテーゼの前面と胸部表面との間に45度の角度で入ります。鈍い鉗子を使用して、プロテーゼが左の空の胸腔内に完全に収まっていることを確認します。次に、チェストを閉じて、前述のようにマウスを監視します。
この手順では、10ミリリットルの血清ピペットから取り外したプランジャー、ニードルアダプター付きの長さ40センチメートルのフレキシブルチューブ、流量制御バルブ、および18ゲージのニードルで構成されるカスタムインフレーションチューブを組み立てます。組み立てたら、ピペットをサイドボードにテープで固定します。ピペットの上部とベンチの間の距離は少なくとも30センチメートルでなければなりません。
麻酔注射でマウスを安楽死させた後、滅菌したボードに固定し、胸部を慎重に開いて胸骨を切り出し、肺葉を露出させます。次に、気管を露出させます。次に、インフレーションチューブに作りたての4%PFAを入れ、チューブからすべての気泡を取り除きます。
次に、針を気管に挿入します。漏れを防ぐために、血管クリップで気管をクリップします。次に、25センチメートルの水の一定の経肺圧で固定剤で肺を膨らませます。
肺を室温で2時間インキュベートし、完全に拡張します。膨張後、固定剤の体積変位に注意してください。次に、気管を結紮し、周囲の結合組織から無傷の肺を静かに解剖します。
ハサミを使って、とても優しくしてください。次に、4%PFAを充填した50ミリリットルの円錐管内で、シェーカーで穏やかに振とうしながら、摂氏4度で12時間肺をインキュベートします。その後、テキストプロトコルに記載されているように、処理と染色を進めます。
MLIを定量化するには、明視野下で20倍の倍率で収集された切片で使用された薬剤の画像を使用します。3つの異なる肺セクションから、重なり合わない合計15のビュー(それぞれが約1平方ミリメートル)をランダムに選択し、それらを排出します。動脈や静脈、主要な気道、または肺胞管のない領域のみを使用してください。
解析では、定規ツールを使用して、選択した各領域に 10 x 10 のグリッドを描画します。したがって、グリッド線は約100ミクロン離れています。次に、2つの隣接する歯槽上皮間の長さとして線に沿った切片を見つけます。
たとえば、両方向矢印は長さを示しています。各グリッド線に沿ってこれらすべての長さを数えると、MLIは切片の長さの平均値です。記載されたプロトコルを用いて、PNX治療マウスを人工移植マウスと比較した。
使用したマウスは生後8週齢のCD-1雄で、左肺葉を切除した。プロテーゼは左肺葉のサイズと形状を模倣しており、左肺葉が取り除かれた後に胸部に挿入されました。手術の14日後、カスタムメイドのインフレーションチューブを使用して、残りの右肺の内容積を測定しました。
PNXを投与した5匹のマウスの右肺の平均容積は約1.4ミリリットルで、これは5匹の人工装足マウスで1.05ミリリットルと有意に多かった。残りの右肺のMLI値も有意に高かった。これらのパラメータを用いて、肺の内部表面積を計算し、プロテーゼを移植したマウスでは有意に小さいことがわかった。
このビデオを見れば、機械的な力によって誘発される肺胞再生マウスモデルの肺の内部表面積を計算する方法について十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、肺切除および人工物移植後のマウスモデルにおける肺内部表面積（ISA）を測定するための標準化された手法を提示します。ISAの正確な定量化は、特に肺疾患や再生の文脈において、肺の形態学および生理学を理解するために不可欠です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 呼吸生理学
- 再生医療
背景
- 肺の内部表面積（ISA）は、肺機能の評価において極めて重要です。
- 測定バイアスは、肺研究の信頼性に影響を及ぼす可能性があります。
- 肺切除術および人工装具の植込みは、一般的な実験モデルです。
- ISAを理解することは、肺の再生プロセスの評価に役立ちます。
研究の目的
- マウス肺におけるISAを測定するための信頼性の高い手法を開発すること。
- 肺機能評価の再現性を向上させること。
- 損傷後の肺再生に関する研究を促進すること。
使用した手法
- 挿管プラットフォーム上でのマウスの準備。
- 小型動物用喉頭鏡を用いた声帯の観察。
- 気管への20ゲージ静脈内挿管カニューレの挿入。
- 肺形態を解析するための術後ISAの測定。
主な結果
- この手法により、ISAの正確な定量が可能になります。
- 肺の研究における測定バイアスを軽減します。
- 生理学的評価の信頼性を向上させます。
- 肺の再生メカニズムに関するさらなる研究を支援します。
結論
- この標準化された手法により、肺形態学的構造の理解が深まります。
- 本手法は、さまざまな実験的肺損傷モデルに適用可能です。
- 今後の研究において、肺の健康状態に関するより詳細な知見を得るために、この技術を活用できます。
よくある質問
業界における重要性
肺内部表面積（ISA）の正確な定量化は、肺疾患モデルや再生研究における呼吸機能の評価において極めて重要です。この標準化された手法により、形態計測における観察者のバイアスが軽減され、前臨床肺研究における信頼性と再現性が向上します。測定の信頼性を高めることで、呼吸器治療薬のターゲットバリデーションにおけるメカニズムのリスク低減と予測価値が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：偏りのないISA測定を提供することで、肺胞再生における治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：研究グループ間での肺形態計測分析を標準化し、ターゲットエンゲージメント評価におけるばらつきを低減する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：肺傷害モデルにおける化合物スクリーニングの機能的エンドポイントとなる、定量的なISA（肺胞空間面積）の読み取り値を提供します。
- 運用的価値：内部肺容量および平均線形切片に関する再現性のあるアッセイを確立し、ハイスループットな形態学的スクリーニングを支援します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：ISAの変化を疾患に関連する肺リモデリングに結びつけることで、再生研究におけるトランスレーショナルなバイオマーカーの整合を可能にします。
- 運用的価値：一貫した形態計測的な機能的リードアウトを提供することで、発見から前臨床検証までの継続性を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、呼吸器研究におけるリード化合物の同定および前臨床段階への進展に関する意思決定に寄与する定量的な形態計測データを提供することで、ディスカバリー生物学のワークフローに組み込まれます。
- 基礎生物学：肺切除後または介入後の正確なISA定量化により、肺再生メカニズムの仮説検証を可能にする。
- スクリーニング：内部肺容量（ILV）および平均線形切片長（MLI）の測定を標準化することで、化合物の効果を評価するためのアッセイ準備を可能にする。
- 分析：ILVおよびMLIの出力からISAを算出し、実験条件を比較するための定量的な指標を提供する。
- トランスレーショナルリサーチ：形態学的変化を機能的な肺容量に結びつけ、肺胞再生モデルにおける前臨床的な連続性をサポートする。
- エンタープライズでの再利用：複数の肺疾患モデルおよび再生研究にわたって利用可能な、肺形態解析の再利用可能な機能を提供する。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： 肺機能評価における予測精度の向上、および再生研究におけるメカニズム上の不透明性の軽減。
- 運用の価値： 肺表面積測定における標準化、再現性、および施設間でのスケーラビリティの確保。
- 戦略的価値： ターゲットバリデーションにおける意思決定（go/no-go）の適正化、信頼性の高い前臨床データによる資本効率の向上、および呼吸器疾患プログラムにおける後半ステージの生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの形態計測学的・機能的な相関に基づいた、肺標的候補物質のリスク調整済み優先順位付け。
実施上の留意点
- 肺切除術および人工物植込み術を含む、マウスの手術手技に関する専門知識が必要です。
- 一貫した肺の膨張および固定を行うため、特製の膨張チューブと固定器具に依存します。
- MLI解析のためには、標準化された組織学的処理および20倍の倍率での明視野イメージングが必要です。
- 再現性のある結果を得るために、手術、組織学、および画像解析グループ間のチーム間標準化が必要です。
- マウスモデルに限定されており、他の種に適応させるには、人工物のサイズおよび膨張パラメータの検証が必要です。
バイオ医薬品 FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Mouse Pnemonectomy (PNX) Surgery
3:28
Mouse Lung Prosthesis Implantation
4:17
Measurement of Internal Lung Volume (ILV)
6:17
Measurement of Mean Linear Intercept (MLI) of Lung Accessory Lobes
7:14
Results: Lung Surface Area After Prosthesis Implantation
8:19
Conclusion
