磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

この実験は、脂質結合タンパク質を同定し、脂質スレの定義された膜環境における脂質とタンパク質の相互作用を解析するために設計されています。細胞ホモジネート由来のタンパク質を、ホスファチジルセリンとセラミドから調製したばかりの脂質ベシクルとともにインキュベートします。その後、反応混合液にXin V結合磁気ビーズを添加し、脂質ベシクルに関連するタンパク質を磁気ビーズに固定します。次に、磁気活性化細胞分取法を用いて、タンパク質結合脂質ベシクルを精製します。

脂質結合タンパク質の結果を特定するには、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを用いて、MDCK細胞で発現させた内因性およびリコンビナントのatypical PKC、ならびに特定のセラミド結合ドメインの精製を示す。ELISAや表面プラズモン共鳴分光法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、脂質とタンパク質の相互作用が膜に近い環境で達成され、かつ結合タンパク質を精製して分析できる点にある。これらの疾患では生理的な脂質とタンパク質の相互作用が損なわれているため、本手法の意義は、脂質が関与する疾患の治療や診断にまで及ぶ。

これらの疾患の中には、標的タンパク質さえ不明であり、特定が必要なものがあります。脂質ベースの治療法を設計するため、まず、等モル量のホスファチジルセリンとC 16 セラミドの乾燥混合物を100 µLのsical緩衝液で調製し、脂質SLEを作成します。0.1 mMの塩化マンガンを添加したsical緩衝液300 µLを加え、1時間ソニケーションします。試料を4°Cで12,000 Gで20分間遠心分離し、得られた巨大脂質小胞のペレットを100 µLのsical緩衝液に再懸濁します。1 nMのvibrant cm DII蛍光色素を添加し、37°Cで1時間インキュベートして、膜分離後のSLE分画を可視化できるようにします。遠心分離により、vibrant cm daiで染色されたホスファチジルセリンおよびセラミドSLEのピンク色のペレットを回収し、100 µLのTris緩衝液に再懸濁します。

次に、界面活性剤を含まない細胞溶解液を調製するため、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む10 millimolar tris, hydrogen chlorideの高張緩衝液300 µL中で細胞を超音波処理し、遠心分離します。膜状の残渣を除去するため、得られた透明な細胞溶解液を脂質物理懸濁液に加え、混合物を4 °Cで2時間インキュベートします。細胞溶解液にはfos-phatidylserineを含む内因性膜が含まれている可能性があるため、追加の遠心分離ステップによって溶解液からこれらの膜を除去することを推奨します。

反応混合液に20 µLのXNV結合バッファーと、XNVが結合した磁気ビーズを含む溶液50 µLを添加し、4 °Cで1時間インキュベートした後、製造元のプロトコルに従って磁気活性化細胞分取（MACS）を行う。次に、抗体競合アッセイにおけるリポソームの有無と量を決定するため、マイクロプレート蛍光リーダーを用いて、フロースルー分画および溶出分画中のvibrant CM DII蛍光をモニターする。A PKCのセラミドホスホセリン小胞に対する結合反応の特異性を検証するために、1 µgのanti P KC Zetaウサギポリクローナル抗体を細胞溶解液とともに4 °Cで1時間インキュベートし、続いて脂質小胞とともにインキュベートする。

in vitroでの脂質タンパク質極性複合体の再構成において、最大溶出液中のセラミドホスファチジルセリンに結合するタンパク質のSDS-PAGEおよび免疫ブロッティング解析を続けます。まず、前述の通り、Vibrant CM-DiIで染色された鮮やかなピンク色のペレットとして調製されたホスファチジルセリンセラミド小胞を用い、これらの小胞を100 µLのTRI bufferに再懸濁します。この際、100 µMの$\gamma$S-GTP、1 mMのGDP、および目的の組換えタンパク質の混合物を添加します。その後、反応液を4 °Cで3時間インキュベートします。次に、20倍濃度のX-inv bufferストック溶液を5 µL、およびX-inv結合磁気ビーズを50 µL添加します。

混合液を4°Cで緩やかに撹拌しながら、さらに30分間インキュベートします。その後、沈殿を促進させるため、メーカーのプロトコルに従ってNX NV磁気活性化細胞分取を継続して行います。溶出分画に10 µgの純化e albuminを添加します。

ウェイル・フルー沈殿法によりタンパク質を濃縮します。底層は、濃縮されたvibrant cm diiを含むクロロホルム・メタノール層で構成されます。茶色の界面には、磁気ビーズと沈殿したタンパク質が含まれています。

Weyl-flu反応の有機クロロホルム・メタノール相において、鮮やかなピンク色のcm diiを検出することにより、ellu脂質小胞を定量します。サンプル間のタンパク質量を標準化するために等量の脂質小胞を使用し、SDS-PAGEおよび免疫ブロット法により分析します。

全長PKC Zettaが緑色蛍光タンパク質またはセラミド結合ドメインにC末端結合し、発現しているMDCK細胞の界面活性剤不含ライセート。pkc. ZettaのC末端はホスホセリンと共にインキュベートされました。

maxカラムからの溶出後、セラミド小胞中のタンパク質をイムノブロッティングにより解析した。セラミド結合断片C20 Zeta、EGFP、およびフルレングスのPKC Zetaがmaxカラムの溶出液（EIT）から回収されており、これはlyx手順の特異性と有効性と一致していた。リン酸セラミド小胞に結合しないネガティブコントロールのEGFPは、溶出液（EIT）中では検出されなかった。

LinxをSDS-PAGEやウェスタンブロッティング、あるいはプロテオミクス解析などの他の手法と組み合わせることで、脂質結合タンパク質複合体にどのタンパク質が含まれているかといった、さらなる疑問を明らかにすることができます。LabXの開発後、単一脂質研究分野の研究者は、神経幹細胞や上皮細胞におけるセラミド誘発アポトーシスや細胞極性の探索が可能となりました。